鱼类生长激素释放肽及其受体的研究进展

摘要：生长激素释放肽（Ghrelin）是生长激素促分泌素受体（Growth hormone secretagogue receptor， GHS-R）的一种内源性配体，主要在胃肠道内产生。目前不少鱼类的Ghrelin基因和氨基酸序列已经确定。鱼类Ghrelin能促进生长激素（GH）、促黄体释放激素（LH）的分泌，并参与摄食调节，表明Ghrelin是一种具有多种生理活性的多肽。综述了鱼类Ghrelin及其受体的结构和分布，并对其调控机理进行了简要介绍，最后论述了Ghrelin在鱼类中的生理功能，旨在为Ghrelin在鱼类营养生理学及内分泌生理学中的研究提供参考。

关键词：鱼类；生长激素释放肽（Ghrelin）；受体；结构与组织分布；生理功能

中图分类号：Q175；S917 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）03-0497-05

生长激素释放肽（Ghrelin）是Kojima等[1]在鼠（Mus musculus）胃中分离出的一种脑肠肽，是生长激素促分泌素受体（Growth hormone secretagogue receptor，GHS-R）的内源性配体。在哺乳动物中，Ghrelin主要在胃中产生，是继生长激素释放激素（Growth hormone releasing hormone， GHRH）和生长抑素（Somatostatin， SRIF）后发现的第三种调节生长激素（Growth hormone， GH）分泌的多肽[2]。近年来，随着对Ghrelin研究的增多，人们发现Ghrelin还具有调节动物摄食、生长和脂肪沉积的功能，在合成代谢中具有重要作用[3]。国内外对鱼类Ghrelin的研究主要集中在其基因的克隆及组织表达方面，也涉及到外源性Ghrelin对机体激素分泌及摄食功能的影响等方面。本文对近年来国内外鱼类Ghrelin及其受体的研究现状进行了概括性综述，旨在进一步促进鱼类Ghrelin研究，为其在水产养殖中的应用奠定基础。

1 Ghrelin的结构与组织分布

Kojima等[1]从鼠胃中分离提纯的成熟Ghrelin含有28个氨基酸残基，相对分子质量约为3 300，N端第三位丝氨酸具有辛酰基化结构，与人的Ghrelin同源性较高，只有2个氨基酸差异。随后又在鼠胃中发现了另一种含有27个氨基酸残基的Ghrelin，其在第14位上少一个谷氨酸[4]。鼠Ghrelin基因含有5个外显子和4个内含子，而金鱼（Carassius auratus）Ghrelin基因序列只有4个外显子和3个内含子[5]。成熟Ghrelin主要有两种分子存在形式，即第三位丝氨酸残基N端辛酰基化和去N端辛酰基化，N端辛酰基化对其生物活性具有重要作用，而去N端辛酰基化Ghrelin的生理功能还不是很清楚[1]。

在人（Homo sapiens）、鼠和牛蛙（Rana catesbeiana）中已经克隆出了Ghrelin的cDNA序列，Unniappan等[5]首次在鱼类中克隆获得金鱼Ghrelin前体的cDNA序列，推测其编码103个氨基酸，包括含26个氨基酸的信号肽，19个氨基酸的成熟肽和C端的55个氨基酸。随后斑马鱼（Danio rerio）[6]、莫桑比克罗非鱼（Oreochromis mossambicus）[7]、斑点叉尾（Ictalurus punctatus）[8]、虹鳟（Oncorhynchus mykiss）[9]等鱼类的Ghrelin也相继被克隆出来。Miura等[10]进一步从金鱼的肠道中分离出了含有14、17、18和19个氨基酸残基的Ghrelin，它们在第三位氨基酸上也具有辛酰基化结构，其中以含17个氨基酸残基的Ghrelin为主。

Ghrelin属于一种胃肠道类多肽，主要在胃中产生，由胃黏膜组织中的X/A样细胞分泌[11]。通过免疫组织化学反应，发现Ghrelin在鼠脑弓状核中存在，随后发现其在鸡（Gallus domesticus）、巴西龟（Trachemys scripta elegans）和蛙胃中也存在[1，12-14]。在鱼类中，雌性与雄性虹鳟的胃中都存在Ghrelin免疫反应，也发现了X/A样细胞的存在[15]。最近，Olsson等[16]报道斑马鱼肠道中也有Ghrelin免疫反应细胞存在。这说明哺乳动物、爬行动物和鱼类的胃和肠道都广泛存在Ghrelin。

对Ghrelin mRNA的组织表达分析发现，Ghrelin主要表达于脊椎动物的胃肠道中，但在中枢神经系统和其他外周组织中也有表达。Kojima等[1]首先检测到Ghrelin mRNA在鼠胃中有表达，随后Date等[17]发现Ghrelin mRNA在鼠的肠道、胰脏、肝脏、心脏、肺、白色脂肪组织、下丘脑、垂体和前脑中叶也存在。在鱼类中，通过RT-PCR和Southern blot分析，首次在金鱼的端脑、下丘脑、肠道、脾脏和鳃中检测到Ghrelin mRNA的存在，而采用Northern blot方法检测则发现其只在肠道中表达，这说明在无胃鱼类中，肠道是其主要的表达部位[5]。Kaiya等[7]研究表明，莫桑比克罗非鱼Ghrelin mRNA在胃中具有较高的表达水平，而在脑、肾脏和鳃中的表达量较低。进一步利用RT-PCR的方法对虹鳟Ghrelin mRNA组织表达进行测定，也发现其在胃中具有很高的表达水平，在脑、下丘脑和肠道中的表达居于中等水平[9]。Parhar等[18]研究发现尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）Ghrelin mRNA只在胃中表达，而在脑、垂体、心脏和肾脏中没有表达。上述研究表明，不同的鱼类中Ghrelin mRNA表达具有物种特异性，但主要在胃肠道中表达，表明Ghrelin与鱼类的消化及摄食调控功能有关。

2 Ghrelin受体的结构与组织分布

Ghrelin的受体GHS-R有1a和1b两种亚型，其中GHS-R 1a有7个跨膜域，而GHS-R 1b仅含有5个跨膜域[19]。GHS-R是一种视紫红质样物质，为典型的G蛋白偶联受体，属于G蛋白偶联受体家族成员[20]。少量GHS-R与Ghrelin结合后即可促进GH的分泌，在内分泌学中具有重要的调节功能。与哺乳动物一样，鱼类的GHS-R基因包含2个外显子和1个内含子。Palyha等[21]首先在河豚（Spheroides nephelus）中分离到了GHS-R基因，它与人的GHS-R序列具有58%的同源性。Chan等[22]发现在黑鲷（Acanthopagrus schlegeli）中，由于GHS-R基因在不同位点的剪切，形成两种转录产物（GHS-R1a和GHS-R1b），且GHS-R1a与哺乳动物的同源性较低；在共同表达的情况下，GHS-R 1b会减弱GHS-R 1a的功能活性，但具体作用方式还不太清楚。

GHS-R在动物不同组织中的分布也具有明显差异。在哺乳动物中，GHS-R主要分布在垂体和下丘脑中，外周组织中含量较少。Kaiya等[23]采用RT-PCR方法，发现虹鳟的两种GHS-R mRNA也主要在垂体和下丘脑表达，其他组织中的表达量较低。Chan等[22]通过放射性PCR方法发现黑鲷GHS-R1a主要在垂体中表达，而GHS-R1b主要在端脑中表达。利用半定量RT-PCR方法发现斜带石斑鱼（Epinephelus coioides）GHS-R1a mRNA主要在脑和垂体中表达，以垂体和下丘脑中最高；而GHS-R1b mRNA则广泛分布于脑和外周组织[24]。鱼类GHS-R mRNA集中分布在垂体和下丘脑中，可能与Ghrelin需要通过中枢神经系统来发挥其生理功能有关。

3 Ghrelin的作用机制

目前，虽然已经发现Ghrelin具有多种生理功能，但对于其作用机制尚不清楚。研究表明，在促进生长激素分泌的过程中，当Ghrelin与其受体结合后可激活磷酸酯酶，磷酸酯酶水解细胞膜内二磷酸脂酰肌醇，使之生成三磷酸肌醇和甘油二酯，然后三磷酸肌醇促使钙从钙库中释放出来，甘油二酯作用于蛋白激酶，打开细胞膜上的钙离子通道，使细胞外的钙离子进入细胞内，细胞内钙离子浓度的上升刺激生长激素的分泌[25]。也有研究认为，Ghrelin是通过对下丘脑进行调节而实现其功能的，因为下丘脑弓状核上存在Ghrelin的神经元。Date等[26]研究了Ghrelin对鼠GH分泌及GH mRNA表达的影响，发现注射Ghrelin后血液中GH含量升高，而GH mRNA与对照组没有显著差异，认为Ghrelin只是促进了GH的分泌，并未提高GH mRNA的转录水平。但是，Unniappan等[27]在体外用Ghrelin孵育金鱼脑垂体时发现其不仅能增加GH的分泌，同时也能促进GH mRNA表达量的上升，认为Ghrelin对GH的合成和分泌作用在不同种类之间也可能存在一定的差异。

4 鱼类Ghrelin的生理功能

已有研究表明Ghrelin是一种多肽，具有多种生理功能。对Ghrelin的早期研究集中在其对哺乳动物的生长调节上，发现其具有促进垂体生长激素的分泌、调节动物摄食、促进胃肠道运动等功能。对鱼类Ghrelin的研究也发现其具有类似的功能。

4.1 促进GH分泌的功能

最初从鼠胃中提取和分离出Ghrelin后，Kojima等[1]就发现辛酰基化的Ghrelin无论在体外还是体内都能促进GH的分泌。此后，在人、猪（Sus scrofa）、牛（Bos taurus）等哺乳动物的研究中也发现Ghrelin能促进GH的释放。在GH分泌的调节中，除众所周知的下丘脑分泌的GHRH可促进GH分泌外，Brazeau等[28]在1973年又从绵羊（Ovis aries）下丘脑中分离得到SRIF，发现其可以抑制垂体GH分泌。Ghrelin是迄今发现的第三种调节GH分泌的激素，使人类对GH的调节机制得到更深入的认识。

在Ghrelin对鱼类GH分泌的调节研究方面，Riley等[29]首先发现用鼠中提取的Ghrelin孵育莫桑比克罗非鱼的离体脑垂体可以刺激GH的释放。Ran等[30]研究发现鼠Ghrelin在10-7 mol/L孵育斜带石斑鱼离体脑垂体6 h后可以显著提高GH和GH mRNA水平，说明Ghrelin不仅能够促进GH的分泌，而且能够促进其合成。以上研究表明，用外源性Ghrelin孵育鱼类离体脑垂体能刺激GH的分泌，这可能与Ghrelin结构的保守性有关。Kaiya等[7]在提取了莫桑比克罗非鱼的Ghrelin后，在不同浓度下对离体脑垂体进行不同时间的孵育，发现Ghrelin在10 nmol/L浓度下能够显著刺激GH的释放。

Kaiya等[9]在对斑点叉尾鮰腹腔注射Ghrelin 1 h后，其血浆GH水平明显升高，但2 h后又恢复到正常水平。Unniappan等[27]在金鱼腹腔注射Ghrelin 15～30 min后即发现金鱼血清GH水平明显上升，随后又减少，说明腹腔注射Ghrelin能在短时间内迅速促进GH的分泌，胃肠道内可能存在Ghrelin的作用靶位。也有研究表明，Ghrelin的类似物也能促进GH的分泌，对莫桑比克罗非鱼腹腔注射人工合成的Ghrelin类似物KP-102（注射量为1 ng/g和10 ng/g），6 h后血浆GH水平明显升高[31]。由于鱼类的中枢神经系统中也存在Ghrelin的受体，所以在鱼类侧脑室注射Ghrelin后也能促进GH的分泌。Unniappan等[27]在金鱼侧脑室注射1 ng/g Ghrelin后，能明显促进GH的分泌，说明Ghrelin可以通过下丘脑-垂体轴来调节GH的分泌。

4.2 促进LH分泌的作用

促黄体生成激素（Luteinizing hormone，LH）是促性腺激素的一种，它作用于成熟的卵泡，引起排卵并生成黄体，也可促进雄性激素的分泌，在动物的生殖过程中具有重要作用。目前，Ghrelin对LH的作用机理还不是很清楚。Kojima等[1]最先报道Ghrelin对鼠垂体LH的分泌没有影响，而Fernandez等[32]发现Ghrelin孵育鼠离体脑垂体可以抑制LH的分泌。最近在研究Ghrelin对鱼类LH的分泌作用时，发现10-6 mol/L的Ghrelin孵育雌性鲤（Cyprinus carpio）的离体脑垂体可明显促进LH的分泌，并发现Ghrelin是通过刺激生殖细胞而发挥作用的，与促性腺激素释放激素（Gonadotropin-releasing hormone，GnRH）具有协同作用[33]。上述研究都是通过离体孵育试验得到的结论，Unniappan等[27]发现无论是在离体孵育还是腹腔或侧脑室注射条件下，Ghrelin都可以在短时间内促进金鱼血清LH水平上升，在一定程度上证明了Ghrelin对鱼类LH分泌具有促进作用。

4.3 摄食调节的功能

在脊椎动物中，摄食调节主要是通过食欲刺激因子与抑制因子来发挥作用，这些食欲因子来源于中枢神经系统或外周组织。在鱼类中较早发现的食欲调节因子主要有神经肽Y（NPY）、食欲素、甘丙肽、促肾上腺皮质激素（CRH）、缩胆囊肽（CCK）、胃泌素释放肽（GRP）及铃蟾肽等[34]。

Ghrelin是新近发现的一种可以调节摄食的胃肠道分泌的多肽。Matthias等[35]对小鼠侧脑室注射人工合成的鼠Ghrelin，可以增加小鼠的摄食能力和体重，且存在剂量依赖性。人类血清中Ghrelin含量在餐前升高，餐后降低，进一步证明了Ghrelin与摄食调控有关[36]。然而，在研究Ghrelin对鸡的摄食调节作用时，雏鸡脑室注射Ghrelin后可抑制鸡的摄食，并存在剂量依赖性[37]。这些研究说明在不同种类中，Ghrelin的摄食调节作用存在一定的差异。

在鱼类中Ghrelin也具有促进摄食的功能。Riley等[38]通过对莫桑比克罗非鱼体内埋置Ghrelin-C10，可以明显提高其摄食能力，增加体重，不过对体长没有显著影响。虹鳟腹腔注射Ghrelin也可以显著提高其摄食率[39]。Miura等[40]对金鱼侧脑室注射1 pmol/g Ghrelin 15 min后可明显促进金鱼摄食，且1 h内其摄食能力没有减退，说明侧脑室注射对摄食的调节比较明显，脑中可能存在与调节食欲有关的受体。Unniappan等[5]对金鱼侧脑室注射己辛酰基化的金鱼Ghrelin-19也发现了类似的效果。

研究表明，鱼类机体处于负能量平衡时会上调Ghrelin mRNA的水平，而处于正能量平衡时会下调Ghrelin mRNA水平，其中研究较多的是摄食和饥饿对Ghrelin表达的影响。Terova等[41]研究饥饿及再投喂对海鲈（Dicentrarchus labrax）胃组织Ghrelin mRNA水平的影响时，发现饥饿4 d后没有产生显著影响，而饥饿35 d后Ghrelin mRNA水平显著升高，即便随后再投喂4 d，其仍处于较高水平。Unniappan等[5]发现饥饿7 d后，金鱼肠道组织Ghrelin mRNA的表达量显著增加，而血清Ghrelin水平早在饥饿第三天就已经显著升高；恢复摄食后，肠道Ghrelin mRNA水平和血清Ghrelin水平降低。莫桑比克罗非鱼摄食前后脑和胃组织中Ghrelin mRNA水平都呈现出先升高后降低的趋势，说明Ghrelin在摄食调节中发挥了一定的作用[42]。

4.4 其他生理功能

在哺乳动物中，Ghrelin在调节免疫功能中能起到一定的作用。Dixit等[43]发现Ghrelin可以抑制人T细胞和单核细胞中促炎症因子的表达。在鱼类中，Yada等[44]发现Ghrelin可以增强虹鳟白细胞的吞噬活性，并促进超氧化物的生成。Kono等[45]发现鲤鱼脾脏细胞在体外经脂多糖、植物凝集素和咪喹莫特刺激后，Ghrelin mRNA的表达量上升。Ghrelin与鱼类的生长也有密切联系。在尼罗罗非鱼的“快速生长期”之前Ghrelin mRNA的表达量增加，Ghrelin还可以影响莫桑比克罗非鱼和虹鳟胰岛素样生长因子的释放[18，46]。Kozaka等[47]研究表明，颅内注射Ghrelin还可以抑制日本鳗鲡（Anguilla japonica）的摄食行为。

5 鱼类Ghrelin研究及其在养殖生产中的应用展望

自十多年前发现Ghrelin以来，许多研究表明Ghrelin在哺乳动物的内分泌、神经、消化、循环和免疫等方面具有多种功能。在鱼类中，虽然国内外已经克隆出多种鱼类Ghrelin基因，发现Ghrelin在促进鱼类摄食、生长，调节激素分泌及糖和脂肪代谢方面具有一定的功能，但与哺乳动物相比，在很多方面的研究仍比较滞后。下一步对鱼类Ghrelin的研究应着眼于探索其在促进生长、免疫调控及繁殖发育等方面的功能和调控作用机制，为Ghrelin在鱼类养殖生产中的实际应用奠定基础。

目前，中国水产养殖产量居世界首位，并呈逐年增长的趋势，水产养殖业在国计民生方面产生了非常重要的影响。如果能将水产学相关理论和研究成果应用于养殖生产当中，将会产生巨大的经济效益和社会效益。首先，由于Ghrelin属于一种上游激素，只需要很少的量即可产生明显效果，而且Ghrelin的肽链比较短，可以被胃肠道直接吸收，因此，如能采取合理的方式将Ghrelin作为饲料添加剂加入饲料中，必将对加快鱼类生长、提高养殖产量等产生积极影响。其次，在鱼类Ghrelin的分泌调控方面，如能通过一定的方式诱导体内Ghrelin基因的表达，也可能产生较好的促生长效果。当然，这都有待于对鱼类Ghrelin的结构及其在内分泌系统中的作用和调控机理进行深入研究和探索。

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