人参总皂苷对MAGE-12的B细胞表位抗体增效作用研究

摘要：目的:研究人参总皂苷对mage-12的B细胞表位抗体的增效作用。方法:将C-57BL/6小鼠随机分为对照组、MAP组、人参总皂苷组，MAP组在预测MAGE-12的B细胞表位序列为QSDEGSSNEEQE(82-93)的基础上，采用4分枝多重抗原肽结构设计合成抗原肽，免疫C-57BL/6小鼠，产生多克隆抗体，应用ELISA实验检测多克隆抗体是否为人的抗原肽的特异性抗体。人参总皂苷组在MAP抗原肽免疫小鼠的同时，人参总皂苷灌胃给药， 0.2mL/20g，每日1次。结果：免疫C-57BL/6小鼠后可产生MAGE-12的抗原特异性的多克隆抗体，且人参总皂苷组抗体效价高于MAP组，达1∶256。 结论：人参总皂苷对MAGE-12的B细胞表位抗体有增效作用。

关键词：B细胞表位； 表位预测； MAGE-12；人参总皂苷；ELISA；增效

中图分类号：R285.5

文献标识码：A

文章编号：1673-7717（2007）04-0689-03

在在过去十几年里，肿瘤抗原的研究取得了很大的进步，这为肿瘤特异性免疫治疗奠定了良好的基础。而肿瘤抗原表位生物学的研究是过渡到临床应用的重要前提。MAGE-12是1994年发现的肿瘤特异性抗原，它分布于各种组织型的肿瘤中，除和胎盘外正常组织不表达，提示是较为理想的靶抗原。本研究在过去预测的MAGE-12的B细胞表位基础上[1]，采用4分枝多重抗原肽结构(MAP, multiple antigenic peptide system)设计合成抗原肽，免疫C-57BL/6小鼠[2]，同时，人参总皂苷灌胃给药， 0.2mL/20g，每日1次，产生多克隆抗体，应用ELISA实验检测多克隆抗体是否为抗原肽的特异性抗体，旨在了解人参总皂苷对MAGE-12的B细胞表位抗体增效作用，为人参总皂苷作为肽疫苗黏膜佐剂的应用提供实验依据。为基于MAGE-12的临床主动免疫治疗研究提供新的手段。

1材料和方法

1.1主要仪器

BIO-RAR Model3500自动酶联检测仪；超声波粉碎器(Somc＆Material,Inc公司）；ABI431A型多肽合成仪(美国PE公司)；FA1104型电子天平(上海天平仪器厂)；Model3550自动酶联检测仪(美国BIO-RAD公司)。

1.2主要试剂

人参总皂苷重庆中药研究所提供；包被物(树脂切割肽)；酶标抗体(辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG)预先滴定工作浓度；SP9002试剂盒：购自北京中山生物技术有限公司 ；完全佐剂(购于北京中山公司)；不完全佐剂(购于北京中山公司)；HMP树脂(美国PE公司)；多肽合成用氨基酸(美国PE公司)；多肽合成试剂(均出自美国PE公司)：哌啶、DMAP、甲醇、HOBt、DCC、DCM、NMP；苯甲硫醚(Sigma)；EDT(Sigma)；TFA(TEDLA)； DMSO(苏州正兴化工研究所)；乙氰(TEDLA)。ELISA包被缓冲液为0.05mol/L碳酸盐缓冲液(pH9.6);洗涤液(PBS-T20)为含0.05% Tween-20的0.02mol/L的PBS（pH7.4）;待测标本及抗体稀释液为含5%小牛血清的PBS-T20；酶标二抗为羊抗兔IgG-HRP(北京中山，ZB-2305)；底物为邻苯二胺(OPD)-H2O2。

1.3多肽的设计

1.3.1多肽序列以Kyte-Doolittle亲水性方案预测肿瘤抗原MAGE-12的B细胞表位，选择序列MAGE-1282-93(QSDEGSSNEEQE)。

1.3.2MAP抗原肽的设计选用B细胞表位，序列为QSDEGSSNEEQE(82-93)。采用4分枝肽设计，结构示意图见图1。

1.4MAP肽的合成

多肽的合成在ABI431A型多肽合成仪(美国PE公司)上进行。采用标准Fmoc方案，精氨酸采用双偶合。多肽合成后，用95%的三氟乙酸（TFA）裂解液将多肽从树脂上裂解下来，同时去除多种保护基团。将反应后的混合液经4C玻璃滤器过滤以滤掉树脂，并用三氟乙酸冲洗反应瓶和滤器。将滤液在常温下低压蒸发至1~2mL，加乙醚50mL使多肽沉淀，经6C玻璃滤器过滤，冷冻干燥，所得便是多肽产品。免疫原为树脂不切割肽，免疫学检测包被抗原为树脂切割肽。

1.5免疫方法及免疫学检测

1.5.1动物及分组C-57BL/6小鼠，2月龄，体重(18±2)g，雌雄不限，随机分为3组（正常组、MAP组、人参总皂苷组），5只/组。以上动物购于北京军事医学科学院丰台六所动物实验中心。

1.5.2免疫方法①MAP组以MAP为免疫原，共注射3次，每次间隔2周，首次以CFA为佐剂，加强免疫以IFA为佐剂。小鼠首次及加强免疫量为50μg/只，与0.3mL佐剂完全乳化后，在窝、腹股沟、腋部皮下及腹腔多点注射。②人参总皂苷(TSPG)组在MAP组免疫方法同时，人参总皂苷灌胃给药0.2mL/20g，每日1次。

1.5.3标本的采集与分离小鼠：末次免疫后3周,眼眶放血,收集血液，分离血清，并冻存于-20℃冰箱备用。

1.5.4ELISA检测抗体采用标准间接ELISA法测定血清中抗体滴度，分别测定每组动物特异性抗体滴度。按100μL/孔包被96孔酶联板(CORNING)，抗原浓度为20μg/mL,4℃过夜；以8% BSA-PBS 37℃封闭120min，洗涤3次，3min/次；加倍比稀释的被测动物血清，100μL/ 孔，37℃孵育90min。洗涤3次后，加入酶标二抗，37℃ 30min;洗涤3次后，加入OPD- H2O2底物，37℃ 10min，终止反应。酶联仪于490nm测定吸光度A值，以正常小鼠血清作阴性对照。结果以双复孔A值均值表示。以待测标本OD值/阴性对照OD值>2.1为阳性标准，以出现阳性反应的最高稀释度作为该样本中抗体滴度。

2结果

小鼠抗体滴度的动态测定。

首次免疫后2周始，取血1次/周，分离血清，以4分枝MAP结构，树脂切割的MAGE-1282-93为包被抗原，ELISA间接法测定特异性抗体滴度，首次免疫3周后即可检出特异性抗体，抗体滴度在测定时间内，抗体滴度逐渐增高，首次免疫后8周，抗体滴度达最高1∶64。抗体滴度随免疫次数和时间升高。结果见图2。

3讨论

抗原刺激是产生免疫应答的前提，故抗原的质和量可直接影响免疫应答的发生发展。在一定范围内，免疫应答水平与抗原的量呈正相关；超过此范围，则反应降低或导致免疫耐受，当抗原在体内耗尽，免疫应答即停止。从这个意义上讲，抗原是调节免疫应答的最关键因素。而佐剂在抗原的质和量一定的情况下，起着至关重要作用。

本研究设计的MAP结构多肽抗原从结构上解决了抗原的质的问题，即表位成分简单，引发的免疫反应针对性强，但其表位肽的分了量小，在体内易降解，因而有免疫原性低的缺陷。本研究采用MAP结构，它是以寡聚赖氨酸为核心的放射状分子肽[3]。寡聚赖氨酸分子量小，免疫原性弱，既往研究已证实，不足以诱发特异性的免疫反应。在恢复其大分子特性后，MAP肽抗原表位重新搭配、组合，表位分子内环境已不同于原来的天然蛋白，虽然表位氨基酸序列未变，但其构象已经发生变化，吴玉章[4]等已证明集体能产生针对表位肽的特异免疫应答。MAP结构的引入是替代传统肽交联蛋白载体并提高免疫原性的有效办法，这为基于表位而设计新型抗原分子的免疫学研究提供了很好的模型。

本研究采用酶联免疫试验间接法，进行了小鼠抗体滴度的动态测定，MAP组、人参总皂苷组最大稀释度分别为1∶64，1∶256，这证明产生的抗体为MAGE-1282-93的特异性抗体。人参总皂苷组抗体效价明显MAP组，此研究结果说明人参总皂苷对B 细胞具有激发作用，促进抗体产生。有研究报道参皂苷对低剂量抗原免疫后的一次抗体反应有明显增强效应,对高剂量抗原免疫后的一次抗体反应几无作用,表明人参皂苷具有免疫调节作用[5]。另有研究报道人参皂苷、人参茎叶及人参多糖,均能刺激小鼠的网状内皮系统的吞噬功能及促进补体和抗体的生成。人参多糖50～100 mg/ kg 时,对特异性免疫和非特异性免疫、细胞免疫和体液免疫均有影响,如果口服人参多糖,可使羊红细胞免疫小鼠的B 细胞增加,血清异性抗体及IgG显著增加,使豚鼠血清补体显著增加[6]。人参能增强网状内皮系统及巨噬细胞等的吞噬功能,现代研究表明:人参中药有效成分人参总皂苷作为合适的生物反应调节剂,既能产生有效的局部免疫应答,增加黏膜免疫的防御作用,又能诱导机体整体免疫应答,延长和提高机体全身免疫保护作用,极有希望开发成新型黏膜疫苗佐剂。且人参皂苷对胃无刺激性且可对抗肠腔分泌,十分适合作为口服疫苗佐剂，本研究结果也证实了上述说法，即人参总皂苷对MAGE-12的B细胞表位抗体有增效作用，为人参总皂苷作为肽疫苗黏膜佐剂的应用提供实验依据。

本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文。