人参皂苷Rb3对肝糖异生AMPK的影响研究

摘要：人参皂苷Rb3，人参二醇型皂苷的一种主要活性成分，已被证明对诱导的糖尿病小鼠模型有抗糖尿病活性。本文为了探讨人参皂苷Rb3在降低血糖方面的分子调控机制，利用HepG2细胞为研究材料，系统分析了人参皂苷Rb3对肝糖异生关键因子AMPK的影响。结值，与AMPK激活剂AICAP～能够协同激活AMPK活性。进一步分析发现，该作用能够被AMPK抑制剂Compound c部分阻断，推测人参皂苷Rb3抑制肝糖异生作用是通过激活AMPK信号通路实现。AMPK信号转导通路作为重要的糖脂代谢靶点，在糖尿病及相关代谢类疾病的调控中发挥着重要的作用，这为探讨人参皂苷Rb3治疗糖尿病的作用机制提供了新的理论依据。

关键词：人参皂苷Rb3；HepG2细胞；腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）；肝糖异生

糖尿病是一种世界性疾病，主要病因为患者体内胰岛素分泌的绝对或者相对不足而引发高血糖和尿糖，长期高血糖还会导致心脑血管、肾、眼及神经组织的病变，给患者造成很大危害。近年来，随着人们生活水平的不断提高，糖尿病患者的数量呈快速上升趋势。因此，开展糖尿病调控机制及防治方面的研究刻不容缓。

糖尿病的治疗方法很多，有胰岛素治疗、胰岛移植、基因治疗、口服降糖药物、“运动治疗”和“饮食治疗”等辅助治疗方法。当前口服降糖药物包括三类，即促进胰岛素分泌类药物、增加胰岛素敏感性药物和a葡萄糖苷酶的抑制剂类药物。随着中药医学的发展，源于中药的降血糖药物种类也不断涌现，该类药物除具有降血糖作用外，兼具有降血脂及改善血液黏度等效果。

人参皂苷Rb3，人参二醇型皂苷的一种成分，引起很大关注，因为具有多种生物活性，如抗抑郁药、抗细胞凋亡的影响，抗氧化活性和微循环的改善、降血糖、抗肥胖、保护血管内皮细胞、神经保护作用、心血管保护作用等活性。前期我们研究发现人参皂苷Rb3能降低糖尿病小鼠血糖；增加血液中葡萄糖耐量和抗氧化；改善血脂紊乱，改善胰岛素敏感性和耐药性。在前期研究的基础上，从分子水平研究人参皂苷Rb3降血糖机理，进行人参皂苷Rb3对肝糖异生AMPK影响研究，为人参皂苷Rb3降血糖机理研究提供理论依据。

1.材料与方法

1.1材料

人参皂苷Rb3（纯度≥98.%HPL C）是上海士瑞化工实业有限公司产品；HepG2细胞系是中国科学院上海细胞所产品；AICAR（AMPK激发剂）、胰蛋白酶、DMEM培养基是美国sigma公司产品；AMPK、P-AMPK和二抗是SantaC ruz Biotechnology公司产品；二甲基亚砜（DMsO）、小牛血清白蛋白、蛋白酶抑制剂是cocktail Roche诊断所产品；MTT（噻唑蓝）是天津市鲁鑫化工科技有限公司产品；Compound C（AMPK选择性抑制剂）、葡萄糖试剂盒是北京北化康泰临床试剂有限公司产品；ECL试剂盒是广州宝泰克生物有限公司产品；X-胶片是EastmanKodak Company公司产品。

1.2细胞培养

将HepG2细胞系冻存管从液氮中取出于37℃水浴液化，然后转移细胞至无菌的离心管（10毫升）中，加3毫升培养基并将细胞混匀，每分钟1000转离心5分钟收集下层细胞系，用含15%的胎牛血清的DMEM培养基培养，次日换液。复苏后的细胞系改用含有10%胎牛血清的D MEM培养基正常培养，当有80%的细胞融合期时，加入0.25%胰蛋白酶处理，并按1：3的比例进行传代培养。当细胞处于对数生长期时，即可用于进一步实验。

1.3MTT检测

采用MTT方法检测人参皂苷Rb3处理24小时后的HepG2细胞活力。人参皂苷Rb3参试浓度包括0，3.125，6.25，12.5，25，50微摩尔・升-1作用。MTT处理细胞一定时间后，弃上清液并加入DMSO以溶解蓝色结晶。利用酶标仪测定490纳米的吸光值，最后计算细胞的生长存活率，细胞存活率=（处理组平均值OD/对照组平均值OD）×100。最后，确定对HepG2细胞无伤害的人参皂苷Rb3浓度，作为进行葡萄糖生成和糖异生实验分析中的最佳给药浓度。

1.4葡萄糖生成检测

参照前人报道的方法进行试验，实验设3个处理，即CON、浓度分别为12.5微摩尔・升-1和25微摩・升-1的人参皂苷Rb3，设3次重复。具体步骤概括如下：首先，将HepG2细胞培养至对数生长期，用24孔培养板每孔接种细胞悬液1毫升，用含10%胎牛血清DMEM培养基在37°C培养（二氧化碳浓度为5%），处理24小时后；换用葡萄糖生成缓冲溶液于37℃（5%二氧化碳含量）培养4小时。最后，将培养液转入EP管中，利用葡萄糖氧化酶法测定其中的葡萄糖浓度。

1.5细胞实验

当HepG2细胞处于对数生长期时，细胞接种于6孔板（密度为每毫升5×104个，3毫升每孔），用DMEM培养（10%胎牛血清）培养。12小时后，放入含有25微摩尔・升-1人参皂苷Rb3和/或1毫摩尔・升-1AICAR和/或10微摩尔Compound C的DMEM培养基。孵育24小时后，用蛋白提取试剂盒提取总蛋白和白。主要检测细胞系中的下列蛋白表达水平，包括AMPK和p-AMPK。

1.6蛋白含量分析

HepG2细胞用预冷的RIPA缓冲液处理，添加蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂。用Bradford法测定蛋白（Bio-Rad蛋白检测试剂盒）。免疫印迹分析被分离的进行的表达通过Western blot检测，用蛋白提取试剂盒提取40pg，总蛋白提取物用12%SD S聚丙烯酰胺凝胶电泳（sDS-PAGE）分离，浓缩胶电泳过程中采用80伏的恒压，分离胶采用160伏。PVDF蛋白杂交膜首先用甲醇浸泡15秒以激活膜，然后放入预冷的转膜缓冲液中。将蛋白胶及转膜装置等按照正确地顺序放置好，然后在100伏简要流程如下：恒压4℃转膜2小时。转膜结束后，用TBST漂洗3次，每次10分钟；然后用5%脱脂奶粉溶液进行封闭处理2小时，也可用5%BSA封闭。采用标准的抗体杂交流程进行第一抗体和第二抗体的杂交实验。将封闭过的膜用含有第一抗体的TBsT溶液4℃孵育过夜；然后，用含有第二抗体TBST溶液在37°C孵育1小时进行杂交；接着用TBST漂洗液室温漂洗3次，每次10分钟；最后，进行ECL试剂处理和X胶片压片处理，获得杂交图片。扫描仪扫描X胶片，利用Quantity One软件对实验的结果进行分析。结果以目的蛋白OD与内参OD比值计算蛋白相对表达量。通过方差分析比较处理之间的差异，p

1.7统计学分析

运用方差分析，data用Mean±SE表示，两组问比较采用t检验分析，所有的统计软件SPSSl3.0（SPSS公司，美国），p

2.结果与分析

2.1人参皂苷Rb3对HepG2细胞葡萄糖生成的影响

通过MTT法进行人参皂苷Rb3活性的检测分析，研究结果表明（见图1），人参皂苷Rb3给药24小时后，浓度为3.125微摩尔・升-16.25微摩尔・升-1，12.5微摩尔-1・升，25微摩尔・升-1时，对细胞产生少剂量的杀伤；而50微摩尔・升-1的Rb3可导致HepG2细胞的明显伤害，表现出细胞的皱缩和凋亡现象。因此，确定合适的人参皂苷Rb3给药浓度为12.5微摩尔・升-1、25微摩尔・升-1进行后面的实验进一步研究。

测定完葡萄糖含量之后用PBS漂洗下层的HepG2细胞；然后用蛋白酶将细胞裂解，并提取蛋白；最后在蛋白定量的基础上将测得的葡萄糖含量与提取的总蛋白含量相比，这个比值可以更为准确地体现人参皂苷Rb3对HepG2细胞中葡萄糖生成能力的抑制效应。研究结果表明（见图2），两个剂量的人参皂苷Rb3均对HepG2细胞系的糖异生具有一定的抑制效应，特别是25微摩尔・升1的剂量可产生显著的抑制作用（p

2.2人参皂苷gb3对HepG2细胞AMPK和p-AMPK表达的影响

为了进一步研究人参皂苷Rb3对糖异生的调控机制，利用AMPK的激动剂AICAR和抑制剂Compound C系统分析了人参皂苷Rb3对AMPK表达的影响。实验中，人参皂苷Rb3的给药浓度为最佳浓度25微摩尔・升-1，设6组处理，分别为CON（对照）组、人参皂苷Rb3组（25微摩尔・升-1）、AICAR组（1毫摩尔・升-1）、CompoundC组（10微摩尔・升-1）、人参皂苷Rb3+AICAR组（25微摩尔・升-1+1毫摩尔・升1）、人参皂苷Rb3+Compound C组（25微摩尔・升-1+10微摩尔・升-1）。研究结果表明（见图3），人参皂苷Rb3和AICAR对AMPK具有一定的激活作用，而且p-AMPK的表达水平有所升高，特别是p-AMPK/总AMPK的比值表现尤为突出（图3）。另外，人参皂苷Rb3和AI CAR表现出了对p-AMPK具有一定的协同效应，同时使用时p-AMPK的表达量显著高于单独使用的表达水平。

使用AMPK的抑制剂Compound C可以显著抑制（p

3.讨论

肝癌细胞系HepG2是来源于人的肝细胞系，该类细胞具有正常肝细胞的基本生物学特性，常用于肝脏糖异生的体外生物学功能研究。在实验过程中，可以测定Hep G2细胞的葡萄糖合成量来反映糖异生情况及其对2型糖尿病治疗的作用。因此，利用HepG2细胞系常作为筛选糖尿病治疗的药物载体，是目前应用的比较广泛的降血糖效应研究手段。

AMPK是细胞和系统的能量平衡调节因子，被缺氧、低糖和营养不足代谢产物激活。在骨骼肌、肝脏和脂肪M织激活AMPK可以提高代谢、改善胰岛素敏感性，并可能有利于糖尿病的治疗。AMPK是一个有吸引力的药物靶点，在全身能量平衡的调节起着关键的作用。肝脏AMPK的激活导致增加脂肪酸氧化，同时抑制肝葡萄糖生产以及脂肪和胆固醇的合成。

为了系统分析人参皂苷Rb3对AMPK的调控机制，本研究中使用了AMPK的抑制剂Compound c和激活剂AICAR，增加了正负对照组及处理的组合，这样实验处理的设置更为系统科学。研究结果发现，人参皂苷Rb3和AMPK的激活剂AICAR对HepG2细胞中的AMPK均具有活性作用，说明AMPK是人参皂苷Rb3作用的重要靶位点。这些结果表明，人参皂苷Rb3对糖异生作用有明显的抑制作用，至少部分相关的人参皂苷Rb3对AMPK的激活和下游信号通路在肝癌细胞中的。在这项研究中，这个反应的HepG2细胞对人参皂苷Rb3对肝脏糖异生作用，AMPK介导的影响，对糖异生的分子调控机制研究的抑制提供了理论依据。