人canstatin cDNA分泌型真核表达载体的表达及生物学作用研究

【摘要】目的将人canstatin cdna分泌型真核表达载体pSecTag2B/canstatin稳定转染中国仓鼠卵巢（CHO-K1）细胞并获得稳定表达canstatin蛋白产物的细胞株。再进一步研究表达产物的生物学作用。方法将人canstatin cDNA的重组1质粒pSecTag2B/canstatin稳定转染CHO-K1细胞，应用RT-PCR、 western-blotting法检测表达产物，再用多种方法进一步研究canstatin的生物学作用。结果成功的将pSecTag2B/canstatin稳定转染CHO-K1细胞并鉴定出上清液中有目的蛋白的表达。该细胞培养上清液能抑制鸡胚绒毛尿囊膜中微血管的生成，抑制人脐静脉内皮细胞（HUVEC-12）的生长并诱导其凋亡。结论 ①成功的将pSecTag2B/canstatin稳定转染CHO-K1细胞并获得能稳定表达canstatin蛋白产物的细胞株;②证实含canstatin蛋白产物的细胞培养上清液具有抑制鸡胚绒毛尿囊膜微血管生成的活性并可在体外抑制HUVEC-12的生长和诱导其凋亡。

【关键词】稳定转染；脂质体；鸡胚绒毛尿囊膜实验；生长曲线；流式细胞学技术

近年来,依据肿瘤生长和转移依赖于血管生成这一基本现象，针对肿瘤血管形成的分子机制所设计的抗血管内皮细胞增殖疗法已成为肿瘤治疗的热点研究领域,血管内皮细胞已成为抗癌治疗的重要靶区。Canstatin是2000年由Kamphaus［1］等发现的一种新的血管生成抑制因子，它具有较强的抑制血管内皮细胞增殖和迁移，诱导内皮细胞凋亡，抑制肿瘤生长的作用［2］。本实验将人canstatin cDNA分泌型真核表达载体pSecTag2B/canstatin稳定转染中国仓鼠卵巢（CHO-K1）细胞以获得稳定表达canstatin蛋白产物的细胞株，再用含canstatin的上清液作用于人脐静脉内皮细胞（HUVEC-12），以便进一步研究canstatin的生物学作用，为探讨canstatin作用机制奠定前期实验基础。

1材料与方法

1．1实验材料

pSecTag2B/canstatin由南华大学肿瘤研究所构建，中国仓鼠卵巢（CHO-K1）细胞购自中南大学湘雅医学院细胞培养中心。人脐静脉内皮细胞（HUVEC-12）由南华大学心血管病研究所馈赠。孵育7 d的受精鸡胚购自衡阳市角山乡孵化厂。 LipofectamineTM2000脂质体转染试剂：美国Invitrogen公司（华美公司）。TaKaRa RT-PCR试剂盒、潮霉素B：宝生物工程（大连）有限公司。western-blotting荧光检测试剂盒：美国Hyclone-prierce公司。6-组胺酸（6-His）抗体由南华大学病原微生物研究所馈赠。辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG购于武汉博士德公司。引物根据Genebank中报告的序列设计而成，并用Primer Premier5．0软件辅助分析：上游引物：5- CCCAAGCTTGTCAGCATCGGCTACCTC -3，下游引物：5- CGGGATCCCAGGTTCTTCATGCACAC-3，上下游引物的5端分别设有Hind III和BamHI酶切位点。PCR引物由大连宝生物公司合成。

1．2实验分组

细胞分为重组载体转染组(pSecTag2B/canstatin CHO-K1) 、空载体转染组(pSecTag2B CHO-K1) 及亲代CHO-K1 细胞组(CHO-K1)。

1．3方法

1．3．1人canstatin cDNA的分泌型重组质粒稳定转染CHO-K1细胞按照试剂盒说明书，利用LipofectamineTM2000脂质体转染试剂分别将pSecTag和pSecTag/canstatin质粒DNA转染丰度为80％的CHO-K1细胞，根据药物剂量反应分析实验结果，以50 ug/ml潮霉素B浓度进行筛选，挑选出阳性克隆并转移至细胞培养瓶中继续培养。

1．3．2 RT-PCR 检测canstatin 基因mRNA 的表达引物设计：P1：5- CCCAAGCTTGTCAGCATCGGCTACCTC -3；P2：5- CGGGATCCCAGGTTCTTCATGCACAC-3。 预计扩增产物长度为684 bp 。将各组细胞用胰蛋白酶消化并离心收集, 用Trizol试剂从细胞中提取总RNA , RT-PCR 检测canstatin 基因mRNA 的表达。反应条件: 94 ℃ 2 min；94 ℃ 40 s，57 ℃（以57 ℃为中心跑梯度PCR，各管退火温度分别为57．5 ℃、56．5 ℃） 40s，72℃ 1 min，33 Cycle；72 ℃延伸 10 min。1%琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物。

1．3．3westernblottiing法检测上清液中重组Canstatin融合蛋白

将各组细胞常规培养至90%融合，弃培养基，PBS洗涤3次，换1%小牛血清培养24 h收集上清，10 000 r/min，室温离心15 min，取上清液作为样品进行SDS-PAGE 电泳。然后将蛋白电转至硝酸纤维素膜上，用含50 mg/ml BSA的TBST封闭2 h；以6-His单抗IgG为一抗，羊抗兔IgG为二抗。westernblottiing法鉴定canstotin 的表达。用ECL发光法显色，曝光，显影，定影。

1．3．4检测pSecTag2B/canstatin转染CHO-K1细胞培养上清液生物学作用蛋白样品收集：分别收集常规条件下培养的正常CHO-K1细胞上清液、CHO-K1/(pSecTag2B・canstatin）上清液、CHO-K1/pSecTag2B（空载体）上清液及正常细胞培养基，1 000 r/min，室温离心5min，取上清液备用。

1．3．4．1鸡胚绒毛尿囊膜实验取孵育8 d 的受精鸡胚，于照卵灯下寻找胚头，在胚头右下方0．5~1．0 cm 处开约0．5 cm×0．5 cm的窗口，暴露绒毛尿囊膜，放大镜下对测试区四级血管记数,然后在各组鸡胚的测试区分别滴加0．2 ml蛋白样品，灭菌透明胶带封口后置37 ℃ 、饱和湿度下孵化至第11 d ，观察并记数血管生长情况，数据以均数±标准差(x±s)表示, 进行单因素方差分析。

1．3．4．2观察细胞形态 用10%小牛血清的RPMI－1640培养基、37 ℃ 、5%CO的条件培养HUVEC-12至对数生长期，弃原培养基，PBS洗涤3次，分别改用收集的各组上清液及正常细胞培养基继续培养48 h。倒置显微镜下观察细胞形态。

1．3．4．3细胞生长曲线将各组细胞分别用胰蛋白酶消化,加入适量培养基制成细胞悬液计数后,以1×105 传代于24 孔细胞培养板中,每组细胞接种21 孔。各组分别改用收集的各组上清液及正常细胞培养基继续培养。每天取3 孔细胞经胰蛋白酶消化后进行细胞计数,取均值描绘细胞生长曲线。

1．3．4．4流式细胞学技术检测canstatin在体外诱导HUVEC-12凋亡常规培养HUVEC-12至对数生长期。弃原培养基，PBS洗涤3次，各组分别改用收集的各组上清液及正常细胞培养基继续培养48 h。胰酶消化后离心(1 000 r/min，5 min)收集细胞，弃上清，加入-20 ℃1ml 75%乙醇，充分混匀，放入-20 ℃冰箱保存。样品送至中国中医研究院基础理论研究所流式细胞室检测。

2结果

2．1转染的阳性克隆

药物筛选10 d，维持培养12 d后倒置显微镜下可见细胞聚集成团状生长，克隆生成。(见图1，10×40倍倒置显微镜下摄像)

图1aCHO-K1/pSecTag2B/canstatin细胞阳性克隆

图1bCHO-K1/pSecTag2B细胞阳性克隆

2．2RT-PCR结果

转染pSecTag2B/canstatin的细胞在700 bp左右扩增出目的条带，与人canstatin cDN段理论长度（684 bp）基本一致。而转染空载体和正常CHO-K1细胞未见目的条带(图2)。

图2RT-PCR结果

2．3western-blotting法检测上清液中目的蛋白

CHO-K1/pSecTag2B/canstatin细胞培养上清液中的表达产物在26 KD 左右有阳性条带显示(图3) ，此蛋白的分子量比实际人Canstatin蛋白分子量（24KD）稍大，这是因为表达的融合蛋白在其N端连接着c-myc表位肽和6－组氨酸尾。而对照组CHO-K1和CHO-K1/pSecTag2B的表达产物，则未见明显的条带。

图3转染细胞表达产物的western-blotting分析

A,B,C: CHO-K1,CHO-K1/pSecTag2B,CHO-K1/ pSecTag2B/canstatin

2．4鸡胚绒毛尿囊膜实验结果

鸡胚绒毛尿囊膜（CAM ）实验结果显示：对照组血管呈叶状生长，加样后血管密度无降低；而canstatin 蛋白实验组加样后能明显抑制鸡胚绒毛尿囊膜血管生成：给药区及其周围血管明显减少，血管纹理欠清晰，小血管分支少，通过鸡胚处理前后血管生成记数，实验组与对照组之间经统计学处理差异有统计学意义 (P

表1

2．5上清液作用HUVEC-12形态学改变

将HUVEC-12分别用正常细胞培养基、CHO-K1细胞上清液、CHO-K1/pSecTag2B（空载体）上清液及CHO-K1/(pSecTag2B・canstatin)上清液培养3 d后，倒置显微镜下观察。对照组细胞增殖明显，形态呈正常短梭形或椭圆形，折光度好，活力较强。CHO-K1/(pSecTag2B・canstatin)上清液培养组细胞体积缩小，形态变圆，与周围的细胞脱离，贴壁能力下降，折光度减低，生长明显受到抑制（图4：10×40倍倒置显微镜下摄像）

图4a、4b、4c正常细胞、CHO-K1、CHO-K1/pSecTag2B上清液培养3 d

图4d：CHO-K1/pSecTag2B/canstatin细胞上清液培养3 d

2．6上清液作用HUVEC-12生长曲线

用正常细胞培养基（a）、CHO-K1细胞上清液（b）、CHO-K1/pSecTag2B（空载体）细胞上清液（c）及CHO-K1/(pSecTag2B・canstatin)细胞上清液（d）培养HUVEC-12 7d并记数，绘制细胞生长曲线。通过数据可见：a、c、d 3组细胞在传代后第1天细胞活性稍减少,经过2～3 d的潜伏期后进入对数生长期,约在第5天进入平台期并持续至第7天。而CHO-K1/(pSecTag2B・canstatin)上清液培养组细胞生长明显受到抑制。

表2：不同细胞上清液培养的HUVEC-12生长曲线

a、b、c：正常细胞、CHO-K1、CHO-K1/pSecTag2B上清液培养3 d

d：CHO-K1/pSecTag2B/canstatin细胞上清液培养3 d

2．7流式细胞学技术检测细胞凋亡

流式细胞学技术检测结果显示用正常细胞培养基、CHO-K1细胞上清液、CHO-K1/pSecTag2B细胞上清液培养HUVEC-123 d后，凋亡率分别为2．15%、1．35%、1．03%，CHO-K1/(pSecTag2B・canstatin)细胞上清液培养组HUVEC-12检测的凋亡率为10．02%，与前3组相比，凋亡率明显增加，提示canstatin可以诱导HUVEC-12凋亡。

3讨论

1971年，Folkman首次提出了“肿瘤生长依赖于血管生成”，抑制肿瘤血管生成可以作为治疗实体瘤的新途径的假说［3］。近年来,随着人们对肿瘤诱导血管生成过程的深入了解,抗血管生成治疗肿瘤的研究取得了巨大的进展,多种天然或合成的有效的抗血管生成因子已见诸报道［4］。鉴于canstatin在恶性肿瘤治疗上的潜在前景，我们较早的开始了canstatin的研究。在之前的实验中，我们从新鲜人胎盘脐带组织中获得canstatin cDNA，成功地构建了pSecTag2B/canstatin分泌型真核表达载体［5］。pSecTag2载体有高效表达重组蛋白的CMV启动子，并能保证基因表达的效率。在表达宿主的选择上，我们选用了中国仓鼠卵巢（CHO-K1）细胞。这是目前应用最广泛的用于稳定表达的哺乳动物细胞之一。外源基因在CHO-K1细胞中经抗生素筛选一般可获稳定长期高效表达。对于重组分泌型质粒pSecTag2B/canstatin在CHO-K1细胞中的表达及鉴定，我们首先采用RT-PCR法在mRNA水平上验证了外源性DNA的成功导入，再用western-blotting法证实目的蛋白在细胞培养上清液中的稳定表达。进行canstatin抑制血管生成的体内生物学活性研究中，通过鸡胚绒毛尿囊膜实验发现含canstatin蛋白的上清液可抑制血管生成，这也进一步提示其对肿瘤及其他病理情况下的血管生成可能具有重要的应用价值。在其对血管内皮细胞的生物学作用研究中，我们先通过观察细胞形态和绘制细胞生长曲线，证实含canstatin的上清对HUVEC-12生长繁殖的抑制效应。我们还选择了流式细胞学技术证实canstatin 抑制血管生成的可能的机制之一就是能够诱导内皮细胞的凋亡。canstatin 作为特异性的血管生成抑制因子,其生物学作用已引起关注, 鉴于其对血管异常增生的抑制作用，除了它对肿瘤治疗的治疗意义之外，它对由于血管生成异常而导致的其它疾病如动脉粥样硬化、类风湿性关节炎等的研究和治疗可能也有较大的价值。我们的实验目前已获得了能稳定表达canstatin蛋白的细胞株，并证实了canstatin在体内的血管生成抑制活性与体外对内皮细胞的部分生物学活性与作用，为canstatin蛋白的大量提取与纯化及对canstatin的其他生物学作用及机制研究打下了良好的基础。

参考文献

1Kamphaus G D , Colorado P C , Panka D J , et al . Canstatin , a novel matrix -derived inhibitor of angiogenesis and tumor growth. J Biol Chem , 2000 , 275 : 1209－1215.

2苏影，朱建思. 癌抑素Canstatin的抗肿瘤作用及其作用机制.肿瘤学杂志，2004，10（5）：353-356.

3Folkman J. Tumor angiogenesis: therapeutic implication. N Engl J Med, 1971; 185: 1182-1186.

4SU Ying , ZHU Jian-si.Canstatin, a endogenous inhibitor of angiogenesis and tumor growth.Chinese Journal of Cancer Research, 2004，16(3):229-234.

5苏影，朱建思，周建国，等.人canstatin基因的克隆及其分泌型真核载体的构建.中国肿瘤，2005，14（1）：42-45.

注：“本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文”