无毛黄瓜同源四倍体诱导及鉴定

摘要：本研究利用不同浓度（0.2%、0.4%、0.8%）秋水仙碱和2%二甲基亚砜（DMSO）混合溶液浸渍无毛黄瓜（2n=2x=14）萌动种子4 h，并通过形态学和染色体鉴定相结合的方法，成功获得了其同源四倍体新种质（2n=4x=28）。结果表明：0.4%秋水仙碱和2% DMSO的混合溶液诱变加倍率为14%，诱导效果最好。与原二倍体相比，同源四倍体生长发育缓慢，节间变短，茎变粗；叶柄、子房和果实缩短变粗，叶面积、花器官变大，果形指数减小；保卫细胞叶绿体数几乎为原二倍体的2倍，气孔变大，四倍体花粉大小不均，且存在少量四孔花粉粒。本研究结果丰富了黄瓜遗传多样性，为选育优质黄瓜品种提供理论基础和丰富种质资源，为创制与无毛基因（gl）有关的整倍体奠定了基础。

关键词：无毛黄瓜；同源四倍体；诱导；鉴定

中图分类号：S642.203 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2016）11-0021-05

Abstract The germinating seeds of glabrous cucumber （2n=2x=14） were immersed in different concentrations of mixed solution of colchicine （0.2%， 0.4%， 0.8%） and 2% dimethylsulfoxide （DMSO） for 4 hours. The autotetraploid （2n=4x=28） was obtained successfully by morphological and chromosome identifications. The results showed that the treatment with 0.4% colchicine and 2% DMSO for 4 hours had the best induction effect with the chromosome-doubled rate of 14%. Compared with their original diploid plants， the autotetraploid plants had slower growth and development， shorter internode， thicker stem， thicker and shorter petiole， ovary and fruit， larger size of leaves and flowers， lower fruit shape index， larger leaf stomata， unevener tetraploid pollen size and little quantity of quadri-aperture pollens. In addition， their chloroplast number of guard cells was almost 2 times of the original diploid plants. The results would enrich the genetic diversity and germplasm resources of cucumber， provide the theoretical basis for high quality breeding of cucumber and lay a foundation for creating euploid which was associated with the glabrous gene gl.

Keywords Glabrous cucumber； Autotetraploid； Induction； Identification

黄瓜（Cucumis sativus L.）属葫芦科（Cucurbitaceae）甜瓜属（Cucumis），栽培历史悠久，种植广泛，是世界性蔬菜作物之一，在人们日常蔬菜消费中占有举足轻重的地位。对黄瓜的遗传研究历来是生物学家及遗传学家的研究重点，且从中发现了众多类型及突变体。无毛突变型黄瓜最早由物理辐射获得[1]。曹辰兴等在黄瓜种质资源研究中，于华北型品种‘大青把’自交系中发现无毛黄瓜突变体[2]，在对无毛黄瓜茎叶表面皮毛性状研究中发现其由一对核基因控制，且无毛基因对果瘤基因存在着隐性上位作用[3]。多倍体化被认为是植物适应和进化的主要机制之一[4]，基因的加倍被认为是植物进化的加速器[5]，染色体加倍是植物尤其是有花植物进化的原动力[6]，倍性育种是育种学家进行物种改良的重要途径之一，同源四倍体是育种学和遗传学研究中重要的中间材料。染色体倍性的增加可提高远源物种之间的可杂交性[7]。同源多倍体与其原二倍体杂交，得到各种非整倍体后可进行该物种部分性状基因定位和连锁遗传分析等方面的研究[8]。已有相关报道对黄瓜同源多倍体的合成条件做了初步说明[9]，但对无毛黄瓜对应四倍体的合成未见相关报道。秋水仙碱能抑制有丝分裂，破坏纺锤体，使染色体停滞在分裂中期，染色体虽然纵裂，但细胞不分裂，不能形成两个子细胞，因而使染色体加倍，被广泛应用于细胞学、遗传学的研究和植物育种中，是多倍体合成最好的药剂之一。

本试验采用染色体倍性操作技术，利用秋水仙碱（colchicine）和二甲基亚砜（DMSO）混合溶液诱变二倍体无毛黄瓜（2n=2x=14），创制其同源四倍体（2n=4x=28）新种质，旨在加深对黄瓜无毛性状的研究，丰富黄瓜遗传多样性，为选育优质黄瓜品种提供依据和丰富种质资源。

1 材料与方法

1.1 试验材料

田间试验于2014年6月―2015年1月在山东农业大学园艺实验站日光温室内进行，室内试验在园艺中心实验室进行。供试无毛黄瓜二倍体由华北型黄瓜品种‘大青把’自交系突变而来。

1.2 试验方法

1.2.1 材料处理 参考Mackiewicz（1996）等[9]的诱导方法，用0.2%、0.4%、0.8%三种浓度的秋水仙碱和2%二甲基亚砜的混合溶液（体积比=1∶1）浸泡0.1～0.5 cm胚根的萌动种子各100粒，蒸馏水处理为对照，置于摇床（振荡速度为50 r/min）上避光处理4.5 h，温度控制在20～25℃。处理后的种子用清水冲洗干净后播入育苗钵（10 cm×10 cm），单粒播种，两叶一心时参照雷春等[10]的方法，初步筛选出疑似诱导株后定植。

1.2.2 形态学观察 出苗后统计成活株数，计算成活率（成活株数/处理株数）；开花结果期观察叶、花、果实和种子；测定叶长、叶宽、叶柄长、叶柄粗、叶片展开度；观察叶片气孔保卫细胞并进行叶绿体计数；观察花粉粒大小和形态。拉秧期测定株高、统计节数，计算平均节间长度。

1.2.3 染色体计数 参考陈劲枫等[11]的方法，略有改动。晴天上午取黄瓜1～2 cm幼嫩卷须，改良Carnoy’s Ⅱ固定液（无水乙醇∶氯仿∶冰乙酸= 5∶2∶3）低温暗处固定24 h，60℃下HCl（1 mol/L）解离15 min，取卷须顶部2～3 mm，改良型石炭酸复红染液染色2～5 min，火焰干燥法制片，镜检。每个卷须观察30个以上分裂相良好的分生细胞。

1.3 数据处理

采用Microsoft Excel 2007作图，DPS 7.05 软件进行统计分析，不同处理间采用LSD法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 秋水仙碱对无毛黄瓜的诱导效果

二倍体无毛黄瓜经过秋水仙碱处理后，出苗时间推迟，出苗后生长明显迟缓，甚至出现死亡现象，子叶和第一片真叶明显变小并向外翻卷皱缩，第一片甚至第二片真叶出现畸形，形似银杏叶。由表1可以看出，随着秋水仙碱浓度的增加，处理材料受抑制程度增大，诱导率在秋水仙碱浓度为0.4%时最大，形态学鉴定与染色体鉴定相符度较高，不同浓度相符度分别为85.71%、87.50%和77.78%。

2.2 无毛黄瓜二倍体与其同源四倍体形态学特征比较

同源四倍体植株与原二倍体相比在外部形态上有较大差异。同源四倍体植株生长发育迟缓，节间变短；茎变粗，与原二倍体有显著差异；植株矮小，与二倍体差异极显著；叶片边缘褶皱，锯齿明显，颜色更浓绿，叶片变厚；叶片增大，叶长增加8.26%，与原二倍体差异不显著，叶宽增加17.66%，与原二倍体差异极显著；叶柄缩短变粗，叶柄长减少25.30%，与原二倍体差异显著，叶柄直径增加48.00%，与原二倍体差异极显著；叶片展开度变大，与原二倍体差异极显著，个别出现叶片夹角处重合现象（表2，图1）。

在开花结果期，四倍体植株开花相对较迟，花朵较大且更鲜艳，雌花花瓣和雄花花瓣长度和宽度均明显变大，雄花花瓣长度增加17.31%，与原二倍体差异显著；宽度增加40.54%；萼片长度增加66.67%，与原二倍体有极显著差异。雌花花瓣长度增加16.67%，宽度增加54.35%，萼片长度增加96.88%，与原二倍体均有极显著差异。子房变短变粗，子房长减少30.00%，子房直径增加82.93%，与原二倍体均有极显著差异。此外，四倍体植株结果率降低，果实的果棱明显，果形指数减少了36.51%，果实多呈“矮胖”状，瓜长减少24.77%，果实直径增加18.45%，二者均与原二倍体有极显著差异（表3，图1）。

2.3 无毛黄瓜二倍体与其同源四倍体解剖学特征比较

由表4可以看出，无毛黄瓜四倍体保卫细胞叶绿体个数与原二倍体差异极显著，前者约为后者的2倍；四倍体气孔器大小和气孔口大小均与原二倍体差异极显著，与原二倍体相比，气孔器平均长度增加63.70%，平均宽度增加23.48%，气孔口平均长度增加47.76%，平均宽度增加51.43%，均与原二倍体有极显著差异。花粉粒直径增大25.84%，差异极显著；四倍体花粉大小不太一致，甚至畸形，且有少量四个萌发孔的花粉粒存在，而二倍体花粉粒大小基本一致，几乎全为三个萌发孔花粉粒，不存在四孔花粉粒（表4，图2）。

3 讨论与结论

3.1 无毛黄瓜四倍体诱导条件的选择

秋水仙碱发现并运用于植物人工加倍始于1937年[12]，目前仍然是植物多倍体诱导中运用最多的化学试剂，且已有较多成功报道。二甲基亚砜（DMSO）在加倍中起到促进秋水仙碱渗透的作用，而其本身并不能加倍[13，14]，但能有效提高诱变效率。本试验利用不同浓度秋水仙碱和2%二甲基亚砜（DMSO）对300粒无毛黄瓜种子进行诱导，共获得了27株同源四倍体材料。其中0.4%秋水仙碱和2%二甲基亚砜（DMSO）的混合溶液诱变加倍率为14%，诱导效果最好。浓度过低，秋水仙碱不能对细胞充分作用，诱导效果较差；浓度过高，虽然能达到一定的诱导率，但是对植株毒害作用严重。此外，已有研究发现一些植物激素和几类抗微管类除草剂，如：甲基胺草磷（amiprophos-metyl， APM）、氟乐灵（trifluralin）、戊炔草胺（propyzamide）、胺磺灵（oryzalin）等也具有使染色体加倍的功能[15-20]，且在某些植物上诱导效果优于秋水仙碱[14，20]，而在黄瓜上应用效果如何仍未可知，有待以后验证。本试验选用萌动的种子作为处理材料，处在这一阶段的细胞合成和代谢旺盛，易于发生突变；诱导时控制在20～25℃，该温度范围利于细胞分裂，从而提高诱导效率。

3.2 无毛黄瓜四倍体的鉴定

倍性鉴定是倍性育种的重要环节，快速、简便、有效地鉴定出植株倍性能大大减少工作量，实现早期筛选和应用，加速育种进程。四倍体与二倍体在形态学和解剖学上有很大差别，这些都可以作为鉴定指标。杜胜利等研究发现，黄瓜叶片气孔保卫细胞的叶绿体数目几乎与植株倍性成正比[21]；管苇等以华北型黄瓜‘长春密刺’二倍体为材料，获得了对应三倍体和四倍体黄瓜材料，发现三倍体和四倍体的气孔长度和宽度与原二倍体相比均显著增加[22]。本研究发现，无毛黄瓜四倍体的保卫细胞叶绿体平均数目几乎为原二倍体的二倍；气孔器和气孔口长度和宽度均比原二倍体大，呈现极显著差异，与上述研究结果一致。但形态学鉴定需要比较丰富的经验且要求研究者对植物遗传规律有较为深入的研究；染色体鉴定虽然准确，却耗时耗力，制片难度系数较大。本试验形态学间接鉴定和染色体计数的直接鉴定结合运用，提高了判断和鉴定的准确性。

参 考 文 献：

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