红球菌R04气囊蛋白的表达

摘要 目的：探讨红球菌r04在联苯培养条件下气囊蛋白的表达。方法：使用实时荧光PCR对红球菌R04在联苯培养条件下气囊蛋白进行定量分析，以明确基因表达水平的变化。结果：与对照相比较，红球菌R04在联苯培养条件下气囊蛋白表达水平整体上调，在对数期上调尤为显著，而到稳定期时表达水平下降。结论：联苯培养的红球菌气囊蛋白表达上调，为研究其气囊蛋白生理功能提供参考数据。

关键词：红球菌R04；气囊蛋白；表达水平；RT-PCR

【分类号】：X172

背景

一百多年前德国微生物学家Klebahn首次在蓝藻细胞中发现了一种具有折光性的亚细胞结构，称为伪空胞[1，2]。其内含有气体，为细胞提供浮力。随后在其他的浮游细菌中也发现了类似的结构特征[3]。

气囊是一种具有折光性的、两端锥形的、由蛋白质构成的圆柱体， 在一定压力下会发生破裂[4]。气囊蛋白GvpA是形成气囊的主要骨架蛋白，单体一个紧挨着一个逐渐形成厚约2nm，长为0.2-1.5μm的囊状结构，气囊蛋白GvpC紧紧附着于此囊泡结构，起着加强固定的作用[7，8，9]。在Pfeifer的报道中介绍了嗜盐细菌、微胞藻属、芽孢杆菌以及链霉菌属等的气囊蛋白基因簇[5]。

本实验室对红球菌Rhodococcus sp. R04基因组测序后也发现其存在气囊蛋白基因簇，经Blast比对后，其序列与Rhodococcus pyridinivorans AK37的相似性高达98%，此基因簇包括8个基因，分别为gvpK，gvpS，gvpL，gvpJ， gvpO， gvpF，gvpG及gvpA。在Offner的报道中，通过对气囊蛋白基因进行突变，发现气囊蛋白除控制气囊形状外，还影响菌株色泽与浑浊度[6]。红球菌R04是土壤微生物，不需要气囊结构来提供浮力，因此本实验室猜想其气囊蛋白存在其他生理功能。

本实验利用RT-PCR对红球菌R04在不同培养条件下不同生长时期气囊结构蛋白表达量进行测定，为下一步研究气囊蛋白生理功能奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1菌株和培养基

红球菌Rhodococcus sp. R04由本实验室保存。基础培养基：（NH4）2SO4， 5 g/L； KH2PO4， 2.93 g/L； K2HPO4・3H2O， 5.85 g/L； MgSO4・7H2O， 0.3 g/L； Nacl，0.2 g/L； Cacl2，0.03 g/L； NiSO4・7H2O， 0.6 mg/L； 微量元素。

1.1.2主要化学试剂和仪器设备

DEPC及Trizol 购自上海生工生物有限公司；Prime Script RT reagent Kit 购自大连TaKaRa公司；SYBR Green PCR Kit购自 QuantiFast公司。日立UV-2010分光光度计购自Hitachi Instruments公司；实时荧光PCR仪器ABI 7900HT （Applied Biosystems， Foster City， CA）；恒温震荡培养箱购自上海智城分析仪器有限公司，Nanodrop 2000购自美国Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 总RNA的分离

将上述以联苯和葡萄糖为碳源培养的红球菌分别于5h（调整期）、14h（对数前期）、24h（对数后期）、36h（稳定期）以及以葡萄糖为碳源培养的红球菌（种子期）于8000×g离心10min收集菌体，彻底弃掉培养基。红球菌R04总RNA的分离按原核生物RNA分离步骤进行。取上述RNA溶液3μl加入 1 μ1的6×上样缓冲液充分混匀于0.7%核酸胶电泳检验。用Nanodrop 2000 测定样品的浓度及A260/A280的比值。

1.2.4 cDNA的获得

将上述RNA溶液使用PrimeScript RT reagent Kit按照说明书37℃金属浴静置15min反转录反应后85℃金属浴静置5s使酶失活。cDNA样本-20℃保存备用。

1.2.5 实时荧光PCR

利用Primer 5.0设计气囊蛋白8个基因以及内参基因16S rRNA的引物序列后由生工生物合成（引物序列未显示）。取小于1ng的cDNA为模板进行实时荧光PCR，每个样品设制平行3组试验。利用两步法PCR扩增标准程序为：95℃预变性10s，1个循环；95℃ 5s，60℃ 10s，设制40个循环。以葡萄糖为碳源培养的红球菌为对照组。根据2-ΔΔCT进行计算它们均值的差值后进行统计学检验[10]。

3 结果

3.1 红球菌R04总RNA的分离

分别提取以葡萄糖或联苯为碳源培养时红球菌R04不同时期的总RNA，经Nanodrop 2000测定样品的A260/A280的比值为1.85-2.0，表明RNA纯度较高，同时进行核酸凝胶电泳检测，出现清晰的5S、16S、23S条带（图片未显示），说明总RNA质纯且完整性良好。

3.2 RT-PCR结果

3.2.1 红球菌气囊蛋白gvpA的表达

气囊蛋白GvpA为合成气囊的主要结构蛋白，通过实时荧光PCR对气囊结构蛋白gvpA的表达水平进行监测，如图1A所示为红球菌R04在以葡萄糖为碳源条件下不同时期气囊蛋白gvpA的表达，由图可见gvpA在对数后期表达量为种子期的8倍左右，而其他时期表达量与种子期相差较小。图1B所示为红球菌R04在以联苯培养条件下气囊蛋白的gvpA表达，与种子期相比较，调整期表达量上调9倍左右，对数前期上调约125倍，对数后期上调约44倍，稳定期上调约12倍。

3.2.2 红球菌气囊蛋白gvpJ和gvpS的表达