免疫荧光微菌落法快速检测药品中致病菌

【摘要】目的建立一种免疫荧光微菌落法快速检测药品中致病菌。方法采用标记有特异性荧光抗体在含有相应性抗原（致病菌）的免疫液体增菌液中粘连性分裂增殖，经过37℃4-6h的培养，形成免疫荧光微菌落（类似培养皿上的菌落），在荧光显微镜下极易被观察到。结果用免疫荧光微菌落法和传统细菌培养法同时检测24份加入痢疾杆菌的样品，本法均能检测出亮度“+++”以上的荧光微菌落；而传统细菌培养法仅检测出18份加入痢疾杆菌的样品。结论免疫荧光微菌落法与传统细菌培养法比较，有较好的特异性，且有较高的灵敏度，操作简便，可提高工作效率。

【关键词】免疫荧光；微菌落；致病菌

免疫微菌落染色法快速检出药品中致病菌【1】目前被认为是一项简便、快速、敏感性和特异性好的实验技术，由于采用的是非特异性美兰染色方法，样品中各种药品的固形成分可被不同程度的染上色，检测样品培养时间长时，有部分菌形成的菌膜与微菌落相混淆，而存在着非特异性问题。本检出法中依据致病菌在含有特异荧光抗体的液体增菌培养基中，能快速粘连性分裂增殖形成荧光免疫微菌落，采用荧光显微镜快速检出药品中致病菌。目前国内还未见报道。作者采用免疫荧光微菌落法快速检出药品中致病菌，为药品中致病菌的检测建立了一种简便、快速的方法，现将结果报告如下。

1实验材料

1.1痢疾杆菌菌株：F1a、F2a、F3a、F4a、F5、F6和宋内氏痢疾杆菌。菌种均来自湖南省疾病预防控制中心和本所保存菌株。

1.2痢疾杆菌荧光抗体制备：按文献报道【2】免疫家兔制备成宋内氏痢疾杆菌和F1a、F2a、F3a、F4a、F5、F6痢疾杆菌7个型免疫血清、试管凝集效价：宋内氏痢疾杆菌为 1:4600，F1-F6均为1：3200以上的7种免疫血清，根据效价按比例混合后，再用硫酸铵盐析法提取免疫血清中抗体蛋白，用荧光素标记此抗体蛋白和纯化荧光抗体，实验用稀释度为1:20.

1.3试验用中成药：归脾丸、六味地黄丸、十全大补丸、补中益气丸、驴胶补血冲剂、川贝止咳糖浆、玉竹膏、雪梨膏，均来自本所中药检测室。

1.4免疫荧光微菌落增菌液：按常规方法配制蛋白胨水，高压灭菌冷却后按1:20（免疫荧光抗体：蛋白胨水）比例混匀制成。

1.5免疫荧光显微镜：XSZ—HY1荧光显微镜，重庆光电仪器总公司重庆光学仪器厂生产。

2实验方法

2.1供试样品制备：在Ⅱ级生物安全柜中，以无菌方法分别将宋内氏和F2a、F3a痢疾杆菌分别植入药丸中，用无菌生理盐水稀释成1:10混悬液；冲剂用无菌生理盐水1:10稀释成混悬液；液体制剂直接用灭菌生理盐水1:1稀释制成混悬液；糖浆剂直接用原液，三种稀释后的混悬液各分三管，再分别加入宋内氏和F2a、F3a痢疾杆菌制成混悬液。

2.2标本制作：用增菌蛋白胨水培养基1:20稀释免疫荧光抗体，混合均匀后，滴加在凹玻片的凹孔中，每孔100μl。用接种环将待检样品一铂环接种在含免疫荧光抗体凹玻片的凹孔中，混匀，再置湿盒中37℃培养4-6小时，取出后再荧光显微镜低倍镜下进行观察。（物镜10x，目镜5x）进行免疫荧光微菌落法检测时，每份样品同时用传统细菌培养法作平行试验。

2.3阳性结果的判断标准：在荧光显微镜下，免疫荧光微菌落的亮度从强到弱，用“++++、+++、++、+”表示，如果免疫荧光微菌落结构疏松，呈雪花状或网状样，亮度在“++”以上时,发现一个免疫荧光微菌落，即可判定为阳性。

2.4传统细菌培养验证方法：采用免疫荧光微菌落阳性培养液，接种在SS平皿和麦康凯平板上，放37℃培养18-24小时，挑取可疑菌落接种三糖铁生化管，再用志贺氏菌属分型血清作玻片血清凝集，作为免疫荧光微菌落的证实试验。

3结果

用免疫微菌落法和传统细菌培养法同时检测24份加入痢疾杆菌的样品。经37℃，4-6小时培养后，免疫荧光微菌落法均能检测出亮度“+++”以上的荧光微菌落，而传统细菌培养法仅检测出18份加入痢疾杆菌的样品，表明免疫荧光微菌落法优于常规法。检测10份不加痢疾杆菌的空白对照样品和10份中成药混悬液中加入正常人粪便的样品，结果在荧光显微镜下均未发现有免疫荧光微菌落形成，表明免疫荧光微菌落法有较好的特异性，检测结果基本可靠。

4 讨论

4.1免疫荧光微菌落法的特点是采用荧光素标记特异性抗体在含有相应抗原（致病菌）的免疫液体增殖液中粘连性分裂增殖，经过37℃4-6小时的培养，可形成免疫荧光微菌落（类似于培养皿上的菌落），在荧光显微镜下容易被观察到，理论上讲，在显微镜下只要找到一个免疫荧光微菌落即可判定为阳性，所以本法有较高的灵敏度【3】。

4.2免疫荧光微菌落法与免疫微菌落染色法比较，由于荧光素标记在特异性抗体上，故免疫荧光微菌落法减少培养后微菌落的染色过程，使其特异性得到了很大的提高，由于检测的样品可在凹玻片上的凹孔中微量培养，取出后即可置荧光显微镜下直接观察结果，操作简便，提高了工作效率。

4.3免疫荧光微菌落法是将免疫学抗原抗体的特异性结合反应与细菌的液体培养法有机结合，使致病菌在含有相应的荧光抗体的液体培养基中不断地凝集性快速生长繁殖，生长繁殖的致病菌又与相应的荧光抗体再结合，经过37℃4-6小时培养，可形成直径100μm左右的免疫荧光微菌落。因抗原抗体结合是特异性的，故本法具有快速、特异的优点。据此，可用其他致病菌的免疫荧光血清，亦可检测出药品中的其他致病菌，因此，免疫荧光微菌落法可作为药品卫生学检验的一项比较理想快速诊断技术。

参考文献

［1］王章云等， 免疫微菌落染色法快速检出药品中的致病菌，［J］中外健康文摘，7（17）：141-142 , 2010

［2］上海市卫生防疫站：卫生防疫检验（细菌检验）P33,1979.［M］上海科学技术出版社。

［3］李柏桂等，免疫荧光微菌落法快速检出痢疾杆菌的试验，［J］中国卫生检验杂志，2000（10）4.