微流控芯片子宫

摘 要 由于体外环境对受精和胚胎发育的影响，现有人工辅助生殖技术存在受精成功率低和胎儿出生后风险高的问题。针对上述问题，本研究发展了一种基于微流控芯片的人工子宫，其特色在于使用子宫内膜细胞胚胎共培养机制，并以连续灌流方式实现细胞与外界物质交换。实验利用上述芯片完成了排卵、受精、着床以及胚胎发生等一系列过程。与传统方法相比，芯片方法不仅操作简便，而且可以获得更高的桑椹胚率和囊胚率。 已经取得的研究结果显示，这种芯片子宫有希望发展成人工辅助生殖的有力工具。

关键词 微流控芯片； 子宫； 共培养； 受精； 胚胎

辅助生殖技术的应用使得不育夫妇得以实现妊娠生子的愿望，由不育引发的相关问题也随之得到解决。体外受精胚胎移植（In vitro fertilizationembryo transplantation， IVFET），即试管婴儿，是辅助生殖技术的重要内容。该技术是指将从母体取出的卵子体外受精并发育成前期胚胎后移植回母体子宫内，经妊娠后分娩婴儿＼[1，2＼]。历经60余年的发展，IVFET已经得到广泛推广并成为治疗不孕症的主要手段。尽管IVFET取得了巨大成功，该技术仍存在许多不足，其中最突出的问题包括妊娠率低、多胎妊娠发生率明显增高和出生后缺陷风险增高＼[3＼]。究其原因，主要是由于现有细胞培养技术不能有效模拟体内条件，因而影响了胚胎质量。因此，现实医疗工作中迫切需要一种能够模拟子宫环境，保证高质量受精和胚胎发育的细胞培养技术。

微流控芯片是组织、器官仿真的有力工具＼[4～9＼]。一方面，微流控通道具有与体内微血管相似的尺寸，在这个尺度下流体所具有的层流特性便于实现精确的流体控制；另一方面，通过芯片材料和芯片结构设计，可以有效模拟组织或器官的结构和功能。前期研究报导了一系列基于微流控芯片的分选、受精以及胚胎发育等单元操作技术＼[10～13＼]。在这些工作基础上，微流控芯片技术有望实现子宫的整体功能以促进胚胎发育和提高胚胎质量＼[14，15＼]。本工作设计了一种微流控芯片子宫，保证在类似子宫内部的环境下实现排卵、受精和胚胎发生。初步结果显示，芯片子宫较之传统细胞培养平台可以获得更高的桑椹胚率和囊胚率。

2 实验部分

2.1 实验材料

细胞呈像使用倒置荧光显微镜（IX71， Olympus）；TS2A四通道独立可控式微量注射泵（保定兰格）；聚碳酸酯（Polycarbonate，PC）薄膜（8 μm 滤孔，英国Whatman公司）；SU8 3025光刻胶（美国MicroChem公司）。聚二甲基硅氧烷（Polydimethylsiloxane， PDMS）前体及引发剂，30 mm培养皿（美国Dow Corning公司）。3氨丙基三乙氧基硅烷（3aminopropyl triethoxysilan， APTES）、PBS 、M16培养基、明胶及透明质酸酶（美国Sigma公司）。矿物油、二甲基亚砜（上海生工（上海）有限公司）。CellTracker Green和CellTracker Red（美国Life Technologies公司）。成年昆明小鼠购自广东省动物实验中心； 小鼠子宫内膜上皮细胞、子宫内膜上皮细胞培养基购自中国齐氏生物科技有限公司。孕马血清促性腺激素（Pregnant mare serum gonadotropin，PMSG）、人绒毛膜促性腺激素（Human chorionic gonadotrophin，HCG）购自杭州动物药品厂。洗液PureSperm Wash（瑞典Nidacon international AB公司）。实验用水为二次蒸馏水。

分 析 化 学第41卷第4期李伟萱等： 微流控芯片子宫 2.2 芯片结构与加工

芯片包含3层结构，顶层和底层为PDMS而中间层为多孔PC膜（图1a）。PDMS层采用标准软刻蚀工艺＼[16＼]加工。首先在平板玻璃上完成SU8模板的制作。取直径为3英寸的玻璃置于浓H2SO4H2O2（3 ∶ 1， V/V）中煮沸30 min，取出后用蒸馏水冲洗3次，并在蒸馏水中超声清洗2次，每次30 min。超声后的玻璃用氮气吹干，备用。将洁净玻璃置于匀胶台，向其中心处滴加SU8 3025光刻胶，匀胶机转速为600 r/min，持续30 s，升高转速至1000 r/min，再持续30 s。铺胶后的玻璃置于烘胶台上进行前烘，95 ℃烘15 min。待玻璃自然冷却后，用掩膜覆盖玻璃表面的SU8胶层，置于紫外光刻机下曝光20 s。曝光后立刻将玻璃置于烘胶台上95 ℃烘15 min。待玻璃自然冷却后将其置于显影液中，轻轻震荡进行显影，之后用电吹风将其吹干。最后，将模板置于175 ℃烘箱中烘1 h，进行坚模以得到SU8模板。将Sylgard184单体与引发剂按体积比10：1混合均匀，导入SU8模板，将模板置于真空气缸内真空脱气。脱气后置于80 ℃烘箱固化1 h，自然冷却后将PDMS从模板上剥离，剥离后在入口和出口处打孔。芯片顶层含有宽500 μm，高110 μm蜿蜒形通道，通道中交错分布一系列用于捕获卵细胞的弧形筛网，筛网直径150 μm，由6根直径35 μm的微柱围成。芯片底层含有4个平行的矩形通道（6 mm×3 mm×110 μm），两端与共同的入口和出口连接。通道底面具有4×3微柱阵列用于支撑PC膜。PC膜处理按照文献＼[17＼]的方法，将PDMS层等离子处理后与APTES处理的PC膜封接，步骤如下：①将需要封接的PDMS及PC膜 表面氧等离子处理1 min；②等离子处理后的PC膜浸泡于5% APTES溶液中20 min；③将PC膜取出，用蒸馏水冲洗3次，以去除表面未结合的APTES，氮气吹干薄膜；④将PDMS与PC膜

2.3 生殖细胞和子宫内膜细胞的准备

IVF公鼠的选择、取精与处理＼[18＼]，具体方法：选择8 周龄以上、体重大于 25 g、雄性特征明显的公鼠，颈部脱臼致死， 剖开腹部取出附睾及输精管， 用小镊子挤压附睾尾部使挤入1 mL 平衡过夜的洗液滴中， 去掉附睾组织， 将此液滴置于 37 ℃、5 % CO2、饱和湿度条件下培养20～25 min， 使自由浮动。获能操作参考洗液试剂盒说明书进行，具体方法：取10 μL上述初步孵育、分散较好的活跃悬浮液加入到 50 μL平衡过夜的洗液滴中， 用血细胞计数器计算浓度并调整至 2×105～5 ×105 个/mL， 将此悬浮液置于 37 ℃、5 % CO2和饱和湿度条件下继续培养 2 h。

IVF母鼠的选择与处理参考文献＼[19，20＼]，具体方法：选择6周龄以上、体重大于20 g的健康母鼠， 每只母鼠腹腔注射10 IU PMSG， 间隔48 h后再注射10 IU HCG， 间隔 13～17 h待用。将上述处理的母鼠于注射 HCG后 13～17 h， 取其输卵管置于1 mL卵细胞洗涤液中， 自输卵管壶腹部取出成熟卵冠丘复合体（Oocytecoronacumulus complex， OCCC），用 0.3 %透明质酸酶溶液处理去除卵丘细胞， 再用50 μL洗涤液冲洗4 次， 得到成熟裸卵。

小鼠子宫内膜细胞在培养瓶中进入指数生长期后收获并制成密度为2×105/mL的细胞悬液备用。

2.4 芯片实验操作

芯片和聚四氟乙烯毛细管在使用之前80 ℃烘烤1 h，微量注射器在75%乙醇中浸泡6 h后用灭菌蒸馏水冲3 次。使用前芯片、毛细管和注射器均置于紫外灯下照射，使用时在超净工作台上将芯片与注射器通过毛细管连接。明胶用灭菌双蒸水配制成0.5%的溶液。部分实验中使用CellTracker Green标记小鼠子宫内膜细胞，以CellTracker Red标记卵细胞。CellTracker工作液使用二甲基亚砜新鲜配置。细胞标记步骤如下：①收集细胞悬液后离心，吸取上清液，加入CellTracker染液于细胞悬液中至终浓度10 μmol/L，37℃孵育30 min；②将细胞离心，弃上清后加入PBS缓冲液，37 ℃孵育10 min；③再次离心并加入PBS缓冲液洗涤细胞，目的在于清除未结合染料。用CellTracker Green标记细胞在荧光显微镜下观察时用蓝光激发观察，而CellTracker Red标记细胞用绿光激发观察。

芯片操作步骤如图2所示：（a）芯片通道出入口1， 4开放，2， 3关闭。操作前先用0.5%明胶溶液灌注芯片通道2 min。微量注射泵抽取20 mL子宫内膜细胞悬液从芯片进样通道缓慢注入，该步骤使子宫内膜细胞沉积在上层通道的卵细胞捕获区。排出剩余细胞悬液后芯片静置于培养箱中静置8 h后，用齐氏实验室配制的子宫内膜培养基以10 μL/h流速灌流培养； （b）培养小鼠子宫内膜上皮细胞24 h后，芯片通道出入口1， 2开放，3， 4关闭，以10 μL/h流速引入小鼠卵细胞悬液以将卵细胞其捕获于微筛网中；（c）继而以10 μL/h流速向通道引入获能，保留6 h完成受精； （d） 芯片通道出入口3， 4开放，1，2关闭，以10 μL/h速度持续灌流M16胚胎培养液。实验期间每隔24 h在倒置显微镜下观察芯片中胚胎的发育情况并拍照记录。

2.5 芯片与传统方法对照实验

对照实验中，在直径30 mm的培养皿中加入胚胎培养液M16 100 μL，覆盖矿物油。每个液滴中约含5个卵细胞。加入获能的，受精后把受精卵移到新的培养液滴中，每24 h更换一次培养液，直到受精卵发育成囊胚。

芯片组的卵细胞样本总数为292，对照组卵细胞样本总数为295。比较芯片方法与传统方法在受精率、4细胞率、桑葚胚率和囊胚率方面的差别。其中，受精率、4细胞率、桑葚胚率和囊胚率分别为发育成2细胞体、4细胞体、16细胞体和32细胞体的受精卵占卵细胞总数的百分比。两组实验数据差异显著性用t检验分析。3 结果与讨论

3.1 微流控芯片设计

本研究借助微流控芯片细致模拟子宫的结构与功能，保证受精和胚胎发生过程在类似体内环境下完成。子宫腔内衬子宫内膜，是直接与受精卵/胚胎接触的部分。为模拟上述结构，研究设计了一种多层微流控芯片，其特色在于以多孔薄膜材料支撑子宫内膜细胞生长，模拟子宫内膜结构（图1b）。实验选用孔径为8 μm的PC滤膜，一方面可以截留子宫内膜细胞，另一方面可以作为细胞培养的支撑并允许培养液经由滤孔扩散为细胞及受精卵提供养分。子宫内膜细胞培养区的微筛网结构可以实现卵细胞定位捕获，这样就模拟体内微环境建立了卵细胞/胚胎子宫内膜细胞共培养体系（见图2）。此外，结合芯片内部设计与外部控制，将卵细胞定位、受精和胚胎形成在芯片上集成，可以尽量减少外界对细胞的干扰。

3.3 芯片子宫内的受精及着床

卵细胞培养24～48 h后，向芯片引入获能的小鼠模拟受精过程。少量接触卵细胞后与其结合，约6 h后完成受精。受精后继续灌流培养，培养液一方面为受精卵不断补充新的营养物质，另一方面可以及时排除代谢废物。受精后约12 h后能观察到小鼠精卵细胞结合。受精卵经过连续多次分裂之后在4 d内形成桑椹胚（16细胞），后者在芯片通道内继续分裂形成囊胚（32细胞），大约在受精后6～8 d进入子宫内膜层完成着床（见图4）。

实验比较了芯片子宫与传统方法获得的2细胞率、4细胞率、桑椹胚率和囊胚率，这些指标可以动态地反映胚胎生成状况。在离体培养哺乳类动物（包括人）受精卵时发现，在一些化学成分确定的培养基中受精卵往往不能发育到囊胚，而是停顿在某个特定的发育时期，这种现象被称作“发育阻断”。“发育阻断”发生的具体机制尚不明了，分析可能是由于体外环境中存在不利于胚胎生成的因素。为了克服胚胎体外发育阻断，实验在芯片上采用卵细胞与子宫内膜细胞灌流共同培养方法，提供高度仿真的微环境以促进胚胎发育。 图5 芯片子宫与传统培养皿中胚胎形成的比较

Fig.5 Comparison of embryo development in petri dish and microfluidic uterus

*： p

结果显示，培养皿组的2细胞体，4细胞体，桑椹胚以及囊胚数目分别为202，149，128和73，而芯片组的对应数值为206，200，159和122。芯片组受精卵各时期地发育情况均优于培养皿组 （图5）。虽然两组的受精情况（2细胞率）大致相当，但在胚胎逐渐发育的过程中体现出明显差异。结果表明，芯片组桑椹胚率和囊胚率明显高于培养皿对照组，以囊胚率的提高最为显著。相对于传统的培养皿方法，本研究发展的芯片子宫方法更有利于提高受精率及囊胚率。与单纯的卵细胞培养相比，微流控芯片子宫更有利于体外小鼠胚胎发育，分析其原因可能为：（1）子宫内膜上皮细胞模拟体内子宫内环境，可分泌一些对早期胚胎发育有利的物质；（2）子宫内膜上皮细胞可能通过与胚胎的相互作用促进其发育；（3）所采用的灌流培养方法模拟了生理状态细胞与外界的物质交换形式，不仅为细胞提供充足的养分， 还可以及时清除对于胚胎发育不利的代谢产物。综上所述，研究通过在微流控芯片上细致仿真子宫的结构和功能形成了一个类似于子宫的微环境。这种芯片子宫有利于卵细胞受精及受精后胚胎的生长发育，并能得到质量较好的胚胎。该技术除可应用于人类生殖医学工程，还可为深入研究胚胎发育机制及动物胚胎工程提供优质的胚胎，具有较为广阔的应用前景。4 结 论

发展了一种微流控芯片子宫，通过使用子宫内膜细胞胚胎共培养以及连续灌流方式细致模拟子宫环境以促进胚胎生成。利用上述芯片子宫，完成了排卵、受精、着床以及胚胎发生等一系列实验过程。芯片子宫不仅操作简便，还可以获得较之传统方法更高的胚胎形成率。我们的后续实验会将芯片子宫发生的囊胚移植到动物子宫，直至发育成胎儿。