黄连生物碱对金黄地鼠血脂代谢及低密度脂蛋白受体基因表达的影响

[摘要] 研究黄连生物碱对低密度脂蛋白受体（LDLR）基因表达和各项降脂指标的影响。通过实时荧光定量PCR检测给药后HepG2细胞和金黄地鼠肝脏中LDLR mRNA 的表达量，同时检测给药前后血清总胆固醇（TC），甘油三酯（TG），低密度脂蛋白胆固醇（LDL-c），高密度脂蛋白胆固醇（HDL-c）含量。结果显示，给药后，与模型组相比，各药物组都有降血脂作用，其中黄连碱、巴马汀和药根碱能降低金黄地鼠血清中TC，TG和LDL-c水平（P

[关键词] 黄连生物碱；LDLR mRNA；胆固醇

[收稿日期] 2013-12-17

[基金项目] 科技部支撑计划项目（2011BAI13B02-1）；2013年重庆市“百名工程技术高端人才培养计划”项目

[通信作者] 叶小利，教授，E-mail：

[作者简介] 吴昊，硕士研究生，E-mail：

高脂血症又称脂质代谢紊乱或异常，引起血浆中总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-c）及甘油三脂（TG）中一种或多种脂质水平超过正常范围。脂质不溶或微溶于水必须与蛋白质结合以脂蛋白形式存在，越来越多的研究证明LDL-c增加是心血管疾病发生的主要危险因子[1]。因此研究开发作用于LDL-c靶点的活性物质具有重要的临床意义。

黄连具有清热燥湿，泻火解毒的功效[2]。研究表明，黄连具有抗菌、抗炎、抗癌、抗氧化、降血糖和降血脂等药理作用[3-4]，其主要活性成分为生物碱，包括小檗碱，黄连碱，巴马汀、表小檗碱和药根碱等。近年来有关小檗碱调节血脂作用的研究逐年增加，研究发现小檗碱（BBR）具有较强的降血功能，其作用机制与现广泛使用的降血脂药――他汀类不同[5-6]，主要是通过稳定低密度脂蛋白受体（LDLR） mRNA的半衰期来增加LDLR mRNA水平，进而增加LDLR的表达[7]，而上调LDLR的表达可以降低LDL-c，以此降低心血管疾病的发生率[8]。黄连生物碱的结构类似，具有相似的药理活性，但对其生物碱降血脂作用和降血脂能力大小的比较鲜有报道。本实验选用金黄地鼠为高脂模型，以TC，TG，LDL-c，HDL-c和LDLR mRNA为指标初步研究黄连生物碱的降血脂作用及其机制。

1 材料

1.1 药物与试剂 小檗碱，巴马汀，黄连碱，表小檗碱，药根碱（纯度>95%）由本实验室提供；辛伐他汀（杭州默沙东制药有限公司，批号H19990366）；RNA提取试剂盒（Invitrogen公司，批号14105）；反转录试剂盒[宝生物工程（大连）有限公司，批号AK4302]；实时荧光定量PCR试剂盒[宝生物工程（大连）有限公司，批号AK4003]；总胆固醇（TC，批号2013024）、甘油三酯（TG，批号2013015）测定试剂盒（长春汇力生物技术有限公司）；LDL-c测定试剂盒（上海荣盛生物药业有限公司，批号20140619）；高密度脂蛋白胆固醇（HDL-c）测定试剂盒（上海荣盛生物药业有限公司，批号 20140521）。金黄地鼠高脂饲料（HFHC）：1%胆固醇、10%猪油、10%蛋黄粉、79%基础饲料，混合制成颗粒。

1.2 细胞与动物 HepG2细胞株，来源于第三军医大学细胞库；金黄地鼠，雄性，体重（100±10） g，许可证号SCXK（京）2012-0001，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

1.3 仪器 Auanti J-30I高速冷冻离心机（美国贝克曼库尔特公司）；CO2培养箱（美国Thermo公司）；倒置生物显微镜（重庆奥特光学仪器有限责任公司）；ELX808酶标仪（BioTek Instruments基因有限公司）；PCR仪（ABI公司）；荧光定量PCR仪（Bio-RAD公司）。

2 方法

2.1 细胞培养及RNA提取 HepG2细胞培养于RPMI-1640培养基（含10% FBS，1%青链霉素混合液），培养条件为37 ℃，5%CO2。实验分为16组：空白组、高、中、低剂量药物组（生物碱为5，1，0.2 mg・L-1）。上药18 h后，弃掉培养基，收集细胞，用TRIzol试剂盒提取细胞的总RNA。取RNA样品2 μL加DEPC处理水稀释，于260，280，310 nm波长处测定吸光度A，以A260/A280表示其纯度，以40×（ A260 -A310）×稀释倍数计算RNA浓度。

2.2 反转录聚合酶连反应 在基因数据库中，查找人和鼠的选定内标GAPHD mRNA 核苷酸序列以及人和鼠的LDLR mRNA核苷酸序列，同时用Primer preminer 5.0 软件设计引物，并由上海英潍捷基贸易有限公司合成，引物序列见表1。采用10 μL逆转录反应体系合成cDNA。按以下条件进行反应：50 ℃反应50 min，85 ℃反应5 min，冰水浴5 min，终止反应，将cDNA模板置于-20 ℃保存。以第1条cDNA为模板，进行实时荧光定量PCR，反应体系为15 μL：Syber Green混液7.5 μL，10 μmol・L-1上游引物和下游引物各0.6 μL，20 mg・L-1 cDNA 5 μL，一级水1.3 μL，反应条件为：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，42个循环；72 ℃ 10 min。实时荧光定量PCR结果，以Ct值比较法计算LDLR mRNA 的相对含量，以归一法计算细胞中药物组/对照组、肝脏中药物组/模型组的倍数差异。

2.3 动物分组及模型建立 金黄地鼠自由饮食，饮水；光照节律12 L：12 D（7：00～19：00），室温（24±2） ℃，湿度（55±10）%。1周后，随机选取10只金黄地鼠作为正常对照组，给正常饲料，其余金黄地鼠喂予高脂高胆固醇饲料。喂养4周后，空腹禁食12 h（不禁水），于眼眶后静脉采血，测定血清中TC，TG，LDL-c和HDL-c含量以判断造模成功与否。将造模成功的金黄地鼠随机均分为7组（n=10）：模型组、辛伐他汀组、生物碱组（小檗碱、黄连碱、巴马汀、表小檗碱、药根碱）。对照组和模型组每天灌胃自来水，辛伐他汀组给药按每天1.2 mg・kg-1，生物碱给药按每天46.7 mg・kg-1，每隔2周测1次体重。

2.4 样品采集、血脂测定及肝脏LDLR mRNA含量的检测 连续给药4周后，空腹禁食12 h（不禁水），于眼眶后静脉采血，测定血清中TC，TG，LDL-c和HDL-c含量。处死金黄地鼠，取肝脏，用冰冷的生理盐水洗去血液，滤纸拭干，提取RNA并检测mRNA含量。

2.5 统计方法 实验数据采用SPSS 17.0统计分析软件处理，数据以±s表示，采用单因素方差分析，多组之间两两相关比较进行t检验。

3 结果

3.1 黄连生物碱对HepG2细胞中LDLR mRNA表达的影响 与对照组相比，小檗碱组、黄连碱组、巴马汀组和药根碱组都能上调HepG2细胞中LDLR mRNA的表达，其中低剂量分别增加0.4，0.5，0.1，0.1倍，中剂量分别增加0.6，0.9，0.4，0.6倍，高剂量组分别增加了1，1.1，0.8，0.9倍。上调LDLR mRNA的表达以黄连碱作用最强，其次是小檗碱、巴马汀和药根碱，表小檗碱作用不明显，见图1。

3.2 黄连生物碱对金黄地鼠体重的影响 由于高脂高胆固醇饲料连续喂养，与对照组相比，从第2周开始模型组体重显著增高（P

3.3 黄连生物碱对金黄地鼠血脂的影响 与对照组相比，模型组血清TC，TG，LDL-c均显著升高（P

3.4 黄连生物碱对肝脏中LDLR mRNA表达的影响 与模型组相比，通过药物处理后，各个药物组都上调了肝脏中LDLR mRNA的表达。辛伐他汀组提高了0.9倍；小檗碱组，黄连碱组、巴马汀组和药根碱组提高LDLR mRNA的量幅度最大，分别增加了1.5，1.9，1.4，1.3倍；而表小檗碱组只提高了0.5倍。结果趋势与细胞实验相一致，见图3。

4 讨论

研究表明血液中总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇水平增多是引发心血管类疾病的主要因素。TC和LDL-c分别降低20%，26%，心脑血管类疾病的死亡率将降低30%左右[9]。动物实验结果表明各个药物组都在一定程度上降低了TC，TG和LDL-c水平，证实了黄连生物碱具有降血脂的功效，可以降低引发心血管类疾病的几率。而黄连碱组、巴马汀组和药根碱组不仅可以显著降低TC，TG和LDL-c水平，同时还显著升高HDL-c水平。胆固醇不能以游离的形式存在于血清中，绝大部分结合于低密度脂蛋白（LDL-c）携带运输，借助细胞膜上的LDL受体（LDLR）介导内吞作用进入细胞，并在细胞内进行分解代谢，最终从血浆中清除[7]。而LDLR是目前研究得最为详尽的脂蛋白受体，其功能就是调节胆固醇在体内的平衡。研究证明[5-7]，小檗碱的降脂作用主要是通过稳定LDLR mRNA的半衰期来增加LDLR mRNA水平，进而增加LDLR的表达，从而促进胆固醇的分解，达到降脂效果。

细胞实验和动物实验结果表明，在细胞LDLR mRNA表达中，小檗碱组、黄连碱组和巴马汀组在低、中和高浓度时都能上调LDLR mRNA的表达，且高剂量黄连碱组上调LDLR mRNA的能力最强。检测肝脏LDLR mRNA表达量实验中，发现小檗碱组、黄连碱组、巴马汀组和药根碱组也都有着上调LDLR mRNA水平，而黄连碱上调幅度最大，这与体外细胞实验结果相一致。由此可见，黄连碱、小檗碱、巴马汀和药根碱降血脂作用可能是通过解除高脂血症对LDLR的转录作用[7]，明显提高LDLR mRNA的表达，增多了LDLR的数量，使得LDL-c的清除加快，因此降低血中TC，LDL-c的水平。

从体重变化上可以看出黄连碱也在一定程度控制动物体重的增长，对肥胖引起血脂升高具有一定的改善作用。

黄连生物碱可以调节脂代谢絮乱，黄连碱作用最强，可能跟小檗碱一样通过调节LDLR mRNA来调节血脂，但具体降脂机制还需进一步研究。

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Effects of alkaloids from Coptidis Rhizoma on blood lipid metabolism and

low-denstity lipoprotein receptor mRNA in golden hamsters

WU Hao， WANG Yan-zhi， WANG De-zhen， PANG Jie， YE Xiao-li， LI Xue-gang

（1.School of Life Science， Southwest University， Chongqing 400716， China；

2.College of Pharmaceutical Sciences， Southwest University， Chongqing 400716， China）

[Abstract] To study the effects of alkaloids from Coptidis Rhizoma on low-density lipoprotein receptor（LDLR） mRNA expression and antihyperlipedemic levels. The LDLR mRNA expression were detected by real time fluorescence quantitative PCR， and the levels of total cholesterol（TC）， triglyceride（TG）， low density lipoprotein（LDL-c） and high-density lipoprotein cholesterol（HDL-c） in serum were measured at the first and last examination. The results show that， after the drug treatment， compared with the model group， each drug group showed a lipid-lowering effect. Especially， coptisine， palmatine， jatrorrhinze were significantly reduced TC， TG， LDL-c（P

[Key words] Coptidis Rhizoma alkaloids； LDLR mRNA； cholesterol

doi：10.4268/cjcmm20141131