菊苣提取物对腹型肥胖大鼠肠道菌群的影响

[摘要] 目的：从肠道菌群探讨菊苣提取物干预腹型肥胖大鼠的药效机制。方法：雄性SD大鼠随机分为5组，即正常组、模型组、菊苣高、低剂量组和非诺贝特组。正常组给予去离子水，其他组给予果糖水并给予菊苣、非诺贝特治疗，生化法检测甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白，测量体重、腹围，实时荧光定量PCR微观观察肠道菌群的变化。结果：与正常组相比，模型大鼠甘油三酯水平、腹围明显升高（P

[关键词] 腹型肥胖；菊苣；肠道菌群；实时荧光定量PCR；果糖

[收稿日期] 2013-12-04

[基金项目] 国家自然科学基金项目 （81073068，81274153）；教育部博士点基金项目（20120013130002）；北京中医药大学科研创新团队项目（2011-CD7D-14）

[通信作者] 张冰，博士生导师，主任医师，主要研究方向为中药药性理论和中药防治代谢性疾病研究，Tel：（010）84738606，E-mail：

腹型肥胖为代谢综合征的首要条件，是糖尿病、痛风、高血压、动脉粥样硬化、心脑血管等多种疾病的独立危险因素。随着人们高果糖饮料摄入的增多，腹型肥胖的发病率越来越高，严重危害着人们的健康。目前认为，肥胖的发病涉及遗传、饮食、肠道菌群等因素。在宿主菌与宿主相互作用过程中，肠道菌群可能是肥胖的触发点之一[1]。课题组前期研究发现，菊苣具有较好的治疗肥胖的作用[2-3]。本研究以肠道菌群为切入点，利用SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR技术，观察菊苣提取物对腹型肥胖大鼠肠道主要条件致病菌和益生菌数量的影响，从肠道菌群角度探讨菊苣的药效机制。

1 材料

1.1 动物 SD 大鼠60只，雄性，体重（220±10） g，SPF级，由维通利华实验动物中心提供，动物合格证号SCXK（京）2012-0001。

1.2 试剂及药物 细菌基因组DNA提取试剂盒，2×Taq Plus PCR Master Mix，50 bp DNA Plus均购于博迈德生物科技有限公司；SsoAdvanced SYBR Green Supermix购于伯乐生物技术有限公司；ERIC-PCR引物委托博迈得生物科技有限公司合成；TG测定试剂盒（货号301181A），TC测定试剂盒（货号111071J）（北京利德曼生化股份有限公司）；琼脂糖，EB溶液均购于拜尔迪有限责任公司。D-果糖（AMRSESCO公司分装）；非诺贝特（北京益民药业有限公司，批号 20120402）；菊粉F97（Cosucra，The Kingdom of Belgium）。

1.3 标准菌株 长双歧杆菌（Bifidobacterium longum，1.2186）、嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus，1.1878）、大肠杆菌（Escherichia coli，1.356）、粪肠球菌（Enterococcus faecalis， 1.101） 均购自中国科学院微生物所菌种保藏中心（冻干粉，4 ℃保存备用）。

1.4 仪器 贝克曼CX4型全自动生化分析仪；恒温低速离心机（法国JOUAN公司）；液体快速混合器（江苏医疗器械厂）；PCR仪（PCR Sprint，Thermo electron，UK）；电泳仪（Biorad，Hercules，CA）；伯乐CFX96实时荧光定量PCR仪。

2 方法

2.1 造模与给药 SD雄性大鼠60只，适应环境3 d后，按体重随机分为正常组、模型组、非诺贝特组和菊苣高、低剂量组，每组12只。各组动物喂饲普通饲料。正常组饮去离子水，其余各组饮10%果糖水[4]。均自由饮食、饮水，饲料和水每天更换1次，并记录饮水量。造模期间给予非诺贝特100 mg・kg-1・d-1灌胃，菊苣提取物高、低剂量组分别予相当于生药量33.3，16.7 g・kg-1・d-1的菊苣灌胃，每天1次，连续7 d。第7天采血1次，收集粪便1次，处死大鼠。

2.2 检测指标 肥胖指标：体重、腹围；生化指标：甘油三脂、 总胆固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白；肠道菌群相关指标：肠球菌、大肠杆菌、双歧杆菌及乳酸菌4种主要宿主菌的数量。

2.3 粪便样本细菌基因组DNA的提取 对粪便样本进行洗涤[5]，洗涤后的样本依照细菌基因组DNA提取试剂盒中的步骤进行提取DNA，-20 ℃保存备用。

2.4 标准菌株DNA提取 分别取标准菌株长双歧杆菌、嗜乳酸杆菌、大肠杆菌、粪肠球菌冻干粉0.025 g，溶于1 mL PBS，然后用细菌基因组DNA提取试剂盒提取DNA，-20 ℃保存备用。

2.5 PCR引物的设计 根据双歧杆菌、乳酸杆菌、大肠杆菌、肠球菌的16S rDNA基因序列设计双歧杆菌属、乳酸杆菌属、肠球菌属的菌属特异性PCR扩增引物和大肠杆菌菌种特异性PCR扩增引物。引物序列见表1。

2.6 引物特异性检测 随机取4个样本进行普通PCR扩增反应。反应体系20 μL：2×Taq Plus PCR Master Mix 10 μL，20 μmol・L-1的上下游引物各0.5 μL，ddH2O 7 μL，DNA模板2 μL；反应条件：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性30 s，T1（双歧杆菌58 ℃，乳酸菌58 ℃，大肠杆菌60 ℃，肠球菌61 ℃）退火30 s，72 ℃延伸1 min，共40个循环。以50 bp DNA Ladder为标准，3%琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物特异性；若特异性较好，对扩增产物进行切胶回收、测序，测后的序列放入BLAST基因库进一步检测其特异性。

2.7 标准曲线制作 对4种标准菌株进行普通PCR，反应体系及反应条件同上；对扩增后的产物进行切胶回收、测序，并用紫外测吸光度A及浓度，计算各标准品1 μL拷贝数，用于做标准曲线。将各标准品做10倍系列稀释，使之稀释成为1×102～1×106，然后进行SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR反应。反应体系20 μL：SsoAdanced SYBR Green Supermix 10 μL，100 μmol・L-1的上下游引物各0.5 μL，ddH2O 8 μL，DNA模板1 μL；反应条件：95 ℃预变性2 min，95 ℃变性5 s，T1（双歧杆菌58 ℃，乳酸菌58 ℃，大肠杆菌60 ℃，肠球菌61 ℃）退火20 s，68 ℃延伸30 s，T2（双歧杆菌85 ℃，乳酸菌83.5 ℃，大肠杆菌85.5 ℃，肠球菌82.5 ℃）保持15 s，双歧杆菌和乳酸菌40个循环，乳酸菌和大肠杆菌30个循环，加溶解曲线：60～90 ℃以0.5 ℃间隔逐渐加热。读取荧光数据和溶解曲线荧光数据，系统自动分析Cq值并生成溶解曲线。

2.8 待测粪便样品 将待测粪便样品中提取的DNA每组随机选取6个样本分别进行4种菌的16S rDNA实时荧光定量分析，反应体系20 μL：SsoAdanced SYBR Green Supermix 10 μL，20 μmol・L-1的上下游引物各0.5 μL，ddH2O 7 μL，DNA模板2 μL；反应条件与标准曲线制备条件相同，循环数均变为40；每次试验设ddH2O代替DNA模板的阴性对照，每个样本同时做3个复孔。反应完毕后根据溶解曲线分析PCR产物的特异性，并由实时荧光定量PCR仪分析定量结果，每份粪便样本所含的4种细菌的拷贝数可通过循环数与标准曲线比较得到。结果以每克湿便的细菌的拷贝数的对数（以10为底数）表示。

2.9 数据统计与分析 采用SPSS 17.0进行统计分析，实验数据以±s表示，组间均数比较，先进行方差齐性检验，若方差齐，2组间均数比较采用ANOVA检验；若2组总体方差不齐，进行秩和检验，P

3 结果

3.1 菊苣对模型大鼠腹型肥胖相关指标的影响 实验7 d各组大鼠体重及腹围的变化：与正常组相比，模型组大鼠体重增加但未见明显变化，腹围明显增大（P

3.2 不同给药时间各组大鼠血清TG，TC，HDL，LDL的变化 与正常组相比，模型组动物血清TG水平显著升高（P

3.3 引物特异性检测 琼脂糖凝胶电泳：4个样本的4种细菌的PCR扩增产物均显示出特异性的条带，与预期DN段相吻合，见图1。

PCR扩增产物测序：肠球菌、乳酸菌、双歧杆菌及大肠杆菌扩增后的基因序列100%与BLAST基因库中的细菌KC002632.1，EU457402.1，JN180852.1及 KC429777.1相吻合。扩增后的序列见表4。

3.4 扩增曲线 各标准曲线10倍系列稀释后进行实时荧光定量PCR反应，可得到1×102～1×106稀释度标准品的模板循环数与荧光强度关系图，可以得出不同稀释度的模板随循环数的增加，其荧光强度逐渐增加，在经过一段指数扩增期后曲线趋于平行，即出现“平台效应”，指数扩增期模板拷贝数与荧光累积值的对应关系形成了定量的基础。

3.5 标准曲线 以稀释倍数为横坐标，以实时荧光定量PCR反应过程中的达到荧光阈值的初始循环数为纵坐标得到各标准菌株的标准曲线，为待测样品的定量提供了依据。肠球菌标准曲线的扩增效率为93.7%，相关系数为0.999；大肠杆菌标准曲线的扩增效率为94.5%，相关系数为0.999；乳酸菌标准曲线的扩增效率为90.0%，相关系数为1.000；双歧杆菌标准曲线的扩增系数为93.2%，相关系数为0.999；均符合实时荧光定量PCR国际标准MIQE指标（扩增效率在90%～105%，相关系数≥0.99）。

3.6 溶解曲线 每次实时荧光定量PCR反应完毕后进行溶解曲线分析，大肠杆菌、肠球菌、双歧杆菌以及乳酸菌的溶解曲线均为单峰，说明扩增过程中未出现非特异性扩增，引物的特异性良好。

3.7 粪便的细菌定量 与正常组相比，模型组动物大肠杆菌、乳酸菌的数量均显著升高（P

4 讨论

4.1 肥胖与肠道菌群的相关性 肥胖是由于机体过多的能量转化脂肪贮存所致，与遗传、环境、饮食、生活方式等因素有关。近年来研究显示，肠道菌群与腹型肥胖密切相关。临床上对肥胖和瘦小的儿童进行横断面研究发现，肥胖比瘦小的儿童，厚壁菌/双歧杆菌的比值明显升高，乳酸菌数量增加[6]；对美国肥胖和瘦的成人采用16S RNA基因测序技术进行初步研究，发现肥胖比瘦的成人厚壁菌/双歧杆菌的比值明显升高[7]；也有人对印度瘦、正常、肥胖和手术治疗的肥胖者的主要的肠道菌群进行比较和定量分析，发现主要细菌的分布没有明显趋势，肥胖的人类杆菌属的细菌变化明显[8]。实验中通过研究改变饮食结构塑造动物的肥胖模型，发现肠道菌群与饮食诱导的肥胖密切相关。

本实验采用高果糖饮食诱导腹型肥胖模型，从肠道内的4种主要宿主菌的数量及比例变化的角度进行研究。研究发现模型大鼠乳酸菌数量增加、乳酸菌/肠球菌也增大，与前人研究相符；研究新发现大肠杆菌的数量也明显增加（P

4.2 菊苣防治腹型肥胖的药效研究 菊苣中的主要成分是低聚果糖菊糖，是一种可溶性膳食纤维。国内外研究发现菊苣具有多种生理活性，具有增强免疫力、抗炎能力、降低血脂、血糖及尿酸的作用，此外还具有保肝、保护主动脉平滑肌细胞等生理功能。

本课题组对菊苣的已经进行十几年的研究，也发现菊苣具有降低腹型肥胖大鼠甘油三酯、减少腹部脂肪堆积的作用[9]；并对菊苣的药效机制进行了初步探讨，发现其3-磷酸甘油醛脱氢酶及心肌脂蛋白脂酶活性的升高、肝中脂肪酸合成酶、游离脂肪酸活性降低有直接或间接的关系[10-11]。

菊苣多糖不能被体内的消化酶消化，所以进入血液中的量比较少，主要存留在肠道内被肠道菌群所酵解，主要对双歧杆菌和条件致病菌进行干预来改变肠道菌群平衡。有研究发现寡果糖和菊粉可提高双歧杆菌的数量，同时将大肠杆菌和梭菌这些可能的致病菌的数量维持在较低水平。本研究在实验室前期研究的基础上，从肠道菌群这一新的视角，探讨菊苣的可能药效机制。研究发现菊苣提取物治疗腹型肥胖的效果显著，可减少模型大鼠腹围，并可使模型甘油三酯的水平降低，与实验室前期结果一致。研究还发现菊苣提取物可使双歧杆菌的数量增加，大肠杆菌减少，这与前人对菊苣对肠道菌群干预作用的研究相符；但菊苣不能使降低的乳酸菌/肠球菌的比值增加。

基于前期的研究和本实验结果，发现菊苣药效机制可能与条件致病菌大肠杆菌的减少、双歧杆菌的增加有关。虽然国内外已经对肠道菌群与肥胖相关性的机制进行了大量的研究，已经确定肥胖患者肠道菌群组成发生变化，但是肠道菌群影响肥胖确切性机制仍不明确，有待进一步研究，肠道菌群对肥胖的贡献幅度仍是未知数。并且菊苣干预肠道菌群后在机体内具体是通过何种途径达到治疗腹型肥胖的效果的，也有待于进一步探讨。

[参考文献]

[1] 刘伟伟，严敏，周丽萍，等.肥胖与肠道菌群的相关性[J].生命科学，2009， 29（6）： 928.

[2] 萨翼，张冰，刘小青，等.菊苣提取物对鹌鹑血尿酸血脂的影响[J].中药新药与临床药理， 2004， 4（15）： 227.

[3] 孔悦，刘小青，张冰，等.菊苣提取物对高尿酸高甘油三酯血症鹌鹑血尿酸血脂的影响[J].北京中医药大学学报， 2004， 27（5）：29.

[4] Laura G Sanchez-Lozada， Edilia Tapia， Adriana Jimenez， et al. Fructose-induced metabolic syndrome is associated with glomerularhypertension and renal microvascular damage in rats[J]. Am J Physiol Renal Physiol， 2007，292： F423.

[5] 殷晓晨.中药祛湿化瘀方对非酒精性脂肪性肝病大鼠肠道菌群结构的影响[D]. 上海：上海交通大学，2012.

[6] Liene Bervoets， Kin Van Hoorenbeeck， Ineke Kortleven， et al. Differences in gut microbiota composition between obese and lean children： a cross-sectional study[J].Gut Pathogens， 2013，5：10.

[7] Nicholson J K， Holmes E， Wilson I D. Gut microorganisms， mammalian metabolism and personalized health care[J]. Nat Rev Microbiol， 2005， 3 （5）：431.

[8] Patil D P， Dhotre D P， Chavan S G， et al. Molecular analysis of gut microbiota in obesity among Indian individuals[J]. J Biosci，2012，37： 647.

[9] 孔悦，张冰，刘小青，等.菊苣提取物对高甘油三酯、高尿酸并高血糖血症大鼠影响的实验研究[J].中华中医药杂志，2005，6（20）：379.

[10] 丁正磊.菊苣组分N1，N2对高甘油三酯并高尿酸血症模型动物的影响及机理研究[D].北京：北京中医药大学，2005.

[11] 李慧，刘小青，张冰，等. 菊苣有效组分对高甘油三酯和高尿酸血症并高血糖大鼠脂代谢的影响[J].中西医结合学报，2008（6）：17.

Chicory extract′s influence on gut bacteria of abdominal obesity rat

SUN Bo-yu， ZHANG Bing， LIN Zhi-jian， LI Li-yu， WANG Hong-po， ZHOU Jun

（Beijing University of Tradional Chinese Medicine， Beijing 100102， China）

[Abstract] Objective： To investigate the efficacy mechanisme of chicory extract interventing abdominal obesity rat from the aspect of gut bacteria. Method： Male SD rats were randomly divided into five groups， namely the normal group， model group， large and small dose group of chicory and the fenofibrate group. Normal group was given deionized water， the other group was given fructose water and give the medical treatment of chicory and fenofibrate. Assay triglycerides， total cholesterol， LDL and HDL by biochemical methods and measure body weight and abdominal circumference and microscopicly observe the count changes of gut bacteria through real-time PCR method. Result： Compared with normal group， the triglyceride level and abdominal circumference were significantly higher（P

[Key words] abdominal obesity； chicory； gut bacteria； Real-time PCR； fructose

doi：10.4268/cjcmm20141127