正交试验优选复方脚癣灵最佳提取工艺

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摘 要：目的：优选复方脚癣灵的提取工艺。方法：采用正交试验，以HPLC法测定提取物中小檗碱和黄芩苷的含量作为评价指标，优选复方脚癣灵的提取工艺。结果：确定的最佳工艺为加10倍量80%乙醇回流提取2次，每次60min。结论：优选的复方脚癣灵提取工艺简单、可行。

关键词：复方脚癣灵；黄芩苷；小檗碱；提取工艺；正交设计

中图分类号：R285.5

文献标识码：A

文章编号：1673-7717(2008)03-0655-02

Optimization the Extraction Process of JiaoXuanLing Complex Prescription by Orthogonal Design

JING Yun-jie1，HUANG Wei-wei1，ZHANG Wen-pin1，FANG Liang2

(1.Branch Hospital of Integrated Traditioinal Chinese and Western Medicine，Hospital Affiliated to Liaoning University of TCM，

Shenyang 110101，Liaoning，China；2.Shenyang Pharmaceuitical University，Shenyang 110015，Liaoning，China)

Abstract：Objective：To optimize the extraction process of JiaoXuanLing Complex Prescription. Methods：The optimum extraction process was investigated by the orthogonal design. The index was the yielding contents of baicalin and berberine hydrochloride in extract which were determined by HPLC. Results：The optimized extraction process was as follow，adding 10 times of 80% alcohol into meal，refluxing and extracting for 2 times，60 minutes every time. Conclution：The optimized process is simple and feasible.

Keywords：JiaoXuanLing Complex Prescription；baicalin；berberine hydrochloride；extraction process；orthogonal design；

复方脚癣灵是由黄连、黄柏、黄芩、苦参等中药材组成，具有清热祛湿、杀虫止痒的作用。处方中的主要成分黄芩苷具有十分明显的抗真菌活性[1]；小檗碱对常见的皮肤癣菌具有抑制作用，且呈量-效反应关系[2]。复方中药的多指标同时测定不但可以节约分析成本，减少分析误差，而且更重要的是它可以直接反映药品的质量[3]。本实验依据黄芩苷和小檗碱的性质，以黄芩苷与小檗碱的含量作为评定指标，两组分同时测定，采用正交试验法对复方脚癣灵提取工艺的主要影响因素进行了考察，为复方脚癣灵提取工艺的确立，提供科学依据。

1仪器与材料

日立L-7100高效液相色谱仪，日立L-7420紫外检测器，天美色谱工作站，梅特勒-托利多AL104电子天平。盐酸小檗碱对照品、黄芩苷对照品由中国药品生物制品检定所提供，药材由辽宁中医药大学附属医院中西医结合分院提供。乙腈(色谱纯)、甲醇(色谱纯)、重蒸水，其它试剂均为分析纯。

2实验方法与结果

2.1色谱条件

色谱柱为Inertsil ODS C18 柱(4.6mm×250mm)；检测波长270nm；流动相：甲醇∶乙腈∶水(32∶15∶58)(用磷酸调至pH2.5)；流速1mL/min；柱温40℃。

2.2线性关系考察

2.2.1对照品溶液的配制分别精密称取黄芩苷对照品0.0100g和盐酸小檗碱对照品0.0226g，再分别置于50mL和100mL的容量瓶中，加甲醇溶解，定容，摇匀，即得浓度为200μg/mL的黄芩苷对照品储备液及浓度为226μg/mL的小檗碱对照品储备液。分别精密移取黄芩苷对照品储备液及盐酸小檗碱对照品储备液至10mL容量瓶中，用倍比稀释法加甲醇得系列质量浓度的黄芩苷对照品和盐酸小檗碱对照品的混合对照品溶液。

2.2.2标准曲线的绘制吸取上述不同质量浓度的混合对照品溶液，按上述色谱条件进样测定，以黄芩苷、小檗碱的峰面积为横坐标(X)，以黄芩苷、小檗碱的质量浓度(C)为纵坐标进行线性回归，得如下回归方程：小檗碱：C=3×10-5X-0.0515，R=0.9999；黄芩苷：C=2×10-5X+0.0268，R=0.9999。结果表明小檗碱和黄芩苷分别在1.13~22.6μg/mL和1.00~20μg/mL范围内呈良好的线性关系。

2.2.3供试品溶液的配制将药物浸膏70%乙醇醇沉，过滤。滤液转移至50mL容量瓶中，加乙醇定容，摇匀。用甲醇将该溶液稀释100倍，即得供试品溶液。

2.2.4阴性样品溶液的制备按照处方比例及工艺制备除去黄芩、黄柏、黄连的阴性醇提液，再将该阴性醇提液按“2.2.3”方法处理得阴性样品溶液。

2.2.5系统适应性试验分别取混合对照品溶液、供试品溶液、阴性样品溶液进样，在上述色谱条件下，阴性样品在对照品、供试品相应色谱峰的位置上无吸收峰，表明处方中的其它成分对测定结果无影响。

2.2.6精密度实验精密吸取同一浓度的混合对照品溶液20μL，按上述色谱条件进样，测定黄芩苷和小檗碱的峰面积，连续进样5次，其RSD分别为3.01%、2.27%。

2.2.7加样回收率实验按照标准曲线制备方法，采用3个浓度样品进样，测定峰面积，将测得的峰面积代入标准回归方程，计算测得量与加入量比较，得回收率，结果见表1。

2.3正交试验优选提取工艺

2.3.1正交试验方案设计 根据脚气洗液方中药物有效成分的性质，采用乙醇回流提取法提取方中药物的有效成分，则乙醇浓度、乙醇用量、提取时间、提取次数4个因素是影响提取效率的主要因素。因此选取这4个因素考察其各自对提取效率的影响。每个因素设定3个水平，制定因素水平表，选用L9(34)正交表安排实验，因素水平安排见表2。

2.3.2 正交试验及结果分析 按处方比例称取黄芩、黄柏、黄连等药物粗粉(均过20目筛)共30g，按表2安排试验。试验后所得提取液减压回收乙醇至无醇味，得浸膏，按2.3.3方法制备得供试品溶液，精密吸取该供试品溶液20μL，进样，测定，并计算其中黄芩苷及小檗碱的含量。试验结果见表3。

从表3直观分析可知，D因素对小檗碱含量的影响最小，故对小檗碱以D因素(提取次数)为误差项进行方差分析；而对黄芩苷含量影响最小的为B因素，故对黄芩苷要以B因素(乙醇用量)为误差项进行方差分析。其分析结果见表4、表5。

从表4可知，各因素对小檗碱含量的影响均无统计学意义；从表5可知，各因素对黄芩苷含量的影响也均无统计学意义。故从表3直观分析可知，各因素对小檗碱含量的影响力大小依次为C>A>B>D，对黄芩苷含量的影响力大小依次为C>A>D>B，故C(提取时间)及A(乙醇体积分数)对黄芩苷和小檗碱的影响是一致的，则在优选工艺时C、A选最佳，即C2、A1。而对于B、D两因素，由于二者对黄芩苷和小檗碱的影响是不一致的，则通过对直观分析结果的综合分析，选定B2、D2为最佳，最终拟定复方脚癣灵的最佳提取工艺为C2A1B2D2，即用10倍量的80%乙醇回流提取两次，每次60min。

3讨 论

多指标成分的分离测定对于复方中药的质量控制具有重要意义。复方中药配伍以后，各指标成分的量不仅可以反映制剂工艺水平，而且可以表征和保证(及其制剂)的药效。本实验采用HPLC法同时测定复方脚癣灵中两个主要指标成分同时含量的方法，该法确定的工艺更加合理。复方脚癣灵中黄连、黄柏为君药，黄芩为臣药。故在实验设计时，应首先以它们主要成分含量的多少来评价提取工艺是否合理，因此本实验选用同时测得的主要成分小檗碱和黄芩苷在提取液中含量的多少作为评定提取工艺优劣的指标。

黄芩苷在275nm处有最大吸收[4]，而小檗碱在265nm和346nm两处都有最大吸收[5]，故选定的检测波长为270nm。因小檗碱和黄芩苷在此波长处的紫外吸收都比较大，可同时测定这两个成分的含量，既经济又减少了实验的次数，是同时测定这两个成分的最佳选择。

小檗碱和黄芩苷常见的提取方法有水提和醇提。但黄连用乙醇处理后总碱含量高，抗菌作用强[6]；而黄芩苷的醇提效率高于水提[7]效率，故本实验选用乙醇作为溶剂进行提取，并选择了可能影响提取的主要因素进行了优化，据此来确定复方脚癣灵的最佳提取工艺。

参考文献

[1] 杨得坡，胡海燕，黄世亮 .黄芩苷元和黄芩苷对皮肤真菌与细菌抑制作用的研究[J].中药材，2000，23(5)：272-274.

[2] 刘春平，赵淑肖，陈强，等.小檗碱抗5种皮肤癣菌实验观察[J].临床皮肤科杂志，2005，34(1)：29.

[3]郝福，蒋晔，李艳荣.HPLC法测定龙胆泻肝丸中龙胆苦苷、黄芩苷和栀子苷[J].中草药，2006，37(12)：1808-1809.

[4]聂鑫，罗佳波，吕本强，等.高效液相色谱法测定黄芩苷粗品中黄芩苷的含量[J].时珍国医国药，2006，17(5)：746-747.

[5]吴春红，谢颖. RP-HPLC法测定黄连中小檗碱含量的研究[J].华西医学，2006，21(3)：467-468.

[6]常明向，高虹，吴梅梅.处理黄连最佳乙醇浓度研究[J].中国药师，2002，5(3)：139-140.

[7]王小平，毛友昌，钟瑞建.黄芩苷醇提工艺优选[J].江西中医学院学报，2003，15(4)：49-50.