绿原酸对Aβ引起的小脑颗粒细胞损伤的保护作用

【摘 要】目的：探讨绿原酸对淀粉样β蛋白（amyloid beta-protein，Aβ）引起的小脑颗粒细胞损伤的保护作用。方法：体外培养小脑颗粒细胞和腹腔巨噬细胞，将经过10μmol/L Aβ预处理48h的巨噬细胞上清液移入神经细胞中，同时加200μmol/L的绿原酸。培养2天后，采用MTT法、western bolt和乳酸脱氢酶检测试剂盒检测细胞活性、微管相关蛋白-2（microtubule- associated protein-2，MAP-2）表达水平和乳酸脱氢酶（lactic dehydrogenase，LDH）漏出量。结果： 将Aβ预处理的巨噬细胞上清液移入到单独培养的小脑颗粒细胞48h后，可使小脑颗粒细胞活性明显降低，仅为正常的28.35%，加入绿原酸后，细胞活性明显增加达到正常的75.82%（P

【中图分类号】R85 【文献标识码】A 【文章编号】1004—7484（2013）11—0008—02

引言

阿尔茨海默病是一种中枢神经系统退行性疾病，最显著的病理学特征是在神经细胞之间出现大量与神经元退行性病变有关的老年斑、神经原纤维缠结和明显的胶质细胞化[1-2]。已有大量相关的实验资料表明Aβ触发了由小胶质细胞参与的炎症反应，使其释放炎性细胞因子，进而导致神经元的丢失和认知功能的下降。绿原酸具有抗炎作用，但对Aβ所致的炎症反应是否具有抑制作用报道较少[3]。因此，本实验拟通过检测绿原酸对经Aβ预处理的巨噬细胞上清液加入培养的小脑颗粒细胞中，细胞的活性、MAP-2和LDH漏出量的影响，以探讨绿原酸对Aβ引起神经细胞损伤的保护作用。

1 材料和方法：

1.1鼠神经细胞培养：出生两三天的SD大鼠乳鼠，无菌条件下取出小脑，置于培养基中，剔除软脑膜和血管。剪成约1mm3小块，加入0.25%的胰酶溶液，消化30min，洗涤3次，制成细胞悬液，调整细胞浓度为106，接种于0.1mg/mL多聚赖氨酸处理过夜的盖玻片的24孔培养板中。置于37℃孵箱中培养，后换液，加入含终浓度阿糖胞苷的培养基继续培养以抑制非神经细胞增殖，以后每2天换液1次，第7天开始实验。

1.2小鼠腹腔巨噬细胞培养：小鼠腹腔注射淀粉肉汤0.5mL，7d 后取腹腔巨噬细胞（锥虫蓝吞噬实验显示99%为巨噬细胞），单独培养接种浓度为106/ml置于37℃孵箱孵箱中培养。接种24h后，向培养基中加入经老化处理的Aβ 至终浓度为10μmol/L，继续培养48h后收集上清。

1.3细胞分组及处理方法：神经细胞随机分为4组，①正常培养的神经细胞，②正常培养的神经细胞+巨噬细胞上清液；③正常培养的神经细胞+巨噬细胞上清液+200μmol/L的绿原酸；④正常培养的神经细胞+10μmol/L Aβ。

1.4 MTT检测细胞活性 在细胞培养48小时后，每孔加MTT溶液（5mg/ml用PBS （ph=7.4）配）20ul。继续孵育4小时，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，每孔加150ul DMSO，振荡10 分钟，使结晶物充分融解。选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，计算活细胞数。

1.5 微管相关蛋白-2表达水平 培养2天后，观察细胞形态并拍照，收集细胞106，提取细胞总蛋白，应用western blot 方法检测微管相关蛋白-2的表达。

1.6 乳酸脱氢酶漏出量 留取培养的上清液，在pH值为10时乳酸基质在氧化型辅酶I存在的情况下，经乳酸脱氢酶催化反应生成丙酮酸，后者与2，4-二硝基苯肼反应生成丙酮酸二硝基苯腙，在波长为440nm下比色测定丙酮酸二硝基苯腙含量，推算出乳酸脱氢酶漏出量（具体操作按照试剂盒说明进行）。

1.7 统计分析：实验结果以 ，应用SPSS13.5分析。

2 结果

2.1 细胞活性的检测 在细胞处理48h后，应用MTT检测与正常培养的神经细胞相比，正常培养的神经细胞+巨噬细胞上清液组细胞的活性明显下降，仅为正常培养神经细胞的28.35%；说明神经细胞在巨噬细胞培养上清（经Aβ活化后）的作用下引起细胞的大量死亡。而在正常培养的神经细胞+巨噬细胞上清液+200μmol/L的绿原酸组，细胞活性为正常培养神经细胞的75.82%，说明在加入绿原酸后，能明显减少神经细胞的死亡起到保护神经细胞的作用。在正常培养的神经细胞+10μmol/L Aβ组，神经细胞的活性为正常培养细胞的91.27%，说明在正常培养的神经细胞中，虽然经过了纯化处理，但仍存在一定的胶质细胞，在Aβ活化后，引起一定神经细胞死亡。

2.2 微管相关蛋白-2表达 在细胞处理48h后，收集细胞，应用western blot 检测，从结果可见，在正常培养的细胞中，MAP-2明显的高表达，但在细胞中加入经Aβ处理的巨噬细胞上清后，MAP-2的表达明显下降，仅为正常组的31.23%（P

MAP-2在1组中明显的高表达，但在2组中下降明显，在三组，表达又有显著的上升，在4组中，仅较1组略低。条带1：正常培养的神经细胞；条带2：正常培养的神经细胞+巨噬细胞上清液；条带3：正常培养的神经细胞+巨噬细胞上清液+200μmol/L的绿原酸；条带4正常培养的神经细胞+10μmol/L Aβ

2.3 乳酸脱氢酶检测 在正常培养的神经细胞中，乳酸脱氢酶的量只有802nkat/L，但在正常培养的神经细胞+巨噬细胞上清液组中，乳酸脱氢酶漏出量显著升高，达到3046 nkat/L，说明神经细胞在加入经Aβ诱导后的巨噬细胞的培养上清液后，大量的神经细胞受损，导致大量的乳酸脱氢酶的漏出，而同时加入绿原酸后，在很大程度上可以减少由巨噬细胞上清液引起的神经细胞膜的损伤，对神经细胞起到明显的保护作用（表2）。

3 讨论

阿尔茨海默病是以进行性痴呆为主要临床特征的神经系统退行性疾病，其病理特征是大脑皮质和海马区域出现神经元缺失、神经炎性斑块和神经原纤维缠结。阿尔茨海默病造成神经元丧失的主要机制是细胞凋亡。许多学者研究表明，Aβ对神经细胞没有直接毒性作用，在纯海马神经细胞培养中加入Aβ，并未出现对神经细胞的杀伤作用[4]。作者对此也进行了初步研究，单独培养的神经细胞中加入Aβ，只见少量的神经细胞死亡，而经Aβ孵育的巨噬细胞的上清液能引起大量的神经细胞凋亡。这些结果表明，Aβ通过激活巨噬细胞，使其释放一些细胞因子，进一步导致神经细胞的凋亡。在单独培养的神经细胞中也出现少量的细胞凋亡，因为在培养神经细胞的过程中即使加入阿糖胞苷，以抑制胶质细胞的生长，但神经细胞不能达到完全纯化，胶质细胞仍存在一定的活性。因此实验中采用Aβ预处理巨噬细胞，再将上清液加入神经细胞培养基中用以模拟体内的生理状态。

绿原酸是从中药杜仲中提取出来的主要活性成分。具有抗炎、抗氧化、抑制氨基酸代谢等药理作用[5]。它能直接对抗炎症介质的作用，降低炎症组织中前列腺素E2的释放量，抑制炎症渗出，从而抑制随后产生的炎症反应。有研究报道，绿原酸的抗炎作用的位点可能是小胶质细胞。本实验结果显示，加入绿原酸组的乳酸脱氢酶漏出量较Aβ预处理巨噬细胞上清组明显减少，对Aβ引起的神经细胞膜损伤具有保护作用；MAP-2是细胞骨架中微管的重要组成成分之一，是神经细胞中的标志性微管相关蛋白，分布于胞体、树突及轴突中。MAP-2可反映神经细胞的存活状态和功能，其变化可代表神经细胞病变。应用经Aβ预处理的巨噬细胞上清可引起神经细胞的微管相关蛋白-2表达明显减少；但在加入巨噬细胞上清液的同时加入绿原酸后，小脑颗粒细胞MAP-2表达明显增加，说明绿原酸能够抑制Aβ引起的神经细胞膜损伤和神经细胞的死亡，对神经细胞具有保护作用。

参考文献：

[1] 王抒，孙兰，杜冠华.p38MAPK—控制阿尔采末病进程的新靶点[J].中国药理学通报，2004；20（5）：595-8.

[2] 刘军，刘岚，曹志中，等.肿瘤坏死因子对创伤后牙髓组织修复的调节作用[J].中国临床康复，2004.8（5）：860-1.

[3] 乌兰，张泽生. 金银花中绿原酸的提取及检测[J]. 食品科学，2011，29（6）：130-134.

[4] 戚向阳，张声华，陆彩玲等 .杜仲叶中绿原酸的提取分离研究[J]. 中草药，2009，19（11）：741-742.

[5] 马希汉，尉芹，景谦平.杜仲叶提取绿原酸的中间试验研究[J]. 林产化学与工业. 2011. 35（03）： 73-76.