绿原酸的提取与分离

摘要：根据现代分离技术课程的特点，选择任课教师科研课题中与现代分离技术密切相关的内容：金银花中绿原酸的提取与分离，将原本孤立的分离技术基础实验改为综合性实验，其内容涉及固体中有效成分的提取技术、减压浓缩技术、紫外检测技术以及硅胶吸附柱层析、硅胶吸附薄层层析和高效液相色谱等现代分离技术。使学生在系统地掌握实验技能的同时，亲身体验了现代分离技术在天然产物研究中的重要作用。

关键词：提取；分离；现代分离技术；实验课程

中图分类号：G642.0；Q946-33 文献标志码：A 文章编号：1674-9324（2014）06-0241-02

现代分离技术是西北农林科技大学应用化学专业的学科基础课程，课程内容包括蒸馏、萃取、结晶、经典色谱、现代色谱等技术。过去我们采用4个实验完成这些技术的操作练习，有些实验技术重复，有些分离技术没有接触到，更主要的是这些分离技术是孤立完成的。为了让学生系统地理解这些分离技术相互之间的关联性，并为天然产物化学等专业课程奠定一定的基础，现代分离技术实验课程将原本孤立的基础实验改为综合性实验，选择了任课教师科研课题中部分相关内容：金银花中绿原酸的提取与分离，此实验包括了现代分离技术课程中大部分技术内容。

一、金银花与绿原酸

金银花为忍冬科忍冬属植物忍冬及同属多种植物的干燥花蕾，它是一种“药食同源”的绿色植物，是临床常用的中药之一。另外，金银花还被广泛地应用于保健品、化妆品、卷烟、食品等行业。近代研究一般认为金银花的主要生物活性有效成分为绿原酸类化合物，并且常以绿原酸含量的高低来评价金银花质量的优劣。绿原酸结构式表示如下：

二、实验方案

金银花中绿原酸的提取分离过程：将金银花粉碎成粉末，然后用75%乙醇索氏提取，所得滤液减压浓缩后60℃干燥得粗提物，将粗提物与硅胶1∶1拌样，将拌好的混合样上硅胶柱，用乙酸乙酯∶甲酸∶水不同比例进行洗脱得到绿原酸的洗脱液，将其浓缩至干，得到绿原酸粗品，再将粗品用硅胶柱分离，用氯仿∶甲醇混合溶液梯度洗脱得到绿原酸精品，最后用高效液相色仪谱检测含量即可。

三、实验方法及预作结果

1.提取过程。将金银花制成粗粉，称取约30g，以75%的乙醇为溶剂，采用索氏提取器提取4h，其提取液减压浓缩后60℃干燥得浸膏。

2.分离过程。（1）粗分离。取一定量上述浸膏，按1∶1加入200～300目硅胶拌样，晾干。用乙酸乙酯湿法装柱（柱型？4.5cm×53cm，硅胶100～200目），干法上样，柱体依次用乙酸乙酯（A）、乙酸乙酯-甲酸-水（20∶1∶0.1）（B）、乙酸乙酯-甲酸-水（10∶1∶0.1）（C）、甲醇（D）洗脱。流速控制在每分钟1/10柱体积即可。分部收集，每管30mL，其中（A）液洗脱收集4管，（B）液洗脱收集8管，（C）液洗脱收集12管，（D）液洗脱收集2管，共4个部分。薄层（TLC）检测，结合显色剂显色，将相同馏分合并。（2）粗分离过程中TLC检测。采用TLC对粗分离过程中柱子的洗脱情况进行跟踪检测，展开剂为乙酸丁酯∶甲酸∶水（7∶2.5∶2.5）。从某个馏分开始有绿原酸出现（365nm波长下显兰色荧光）至几乎看不到兰色荧光，表示绿原酸已基本收集完全。具体方法描述如下：①收集液的TLC预检。在对各收集管进行TLC分析之前，为了节约薄板，可用毛细管将各收集管中的液体依次在一块薄板上并对各点样按照相应的管号一次编号，等样点上的溶剂彻底挥发干后，置于波长365nm的紫外灯下观察，有明显斑点的表明其对应接受管中含有化合物，没有斑点的表明对应管中没有化合物。然后再对有斑点的各管进行TLC分析。②TLC分析。TLC分析的内容包括：第一，判断斑点数的多少。展开后，斑点数多表明所含化合物越多。只有一个斑点者表明对应管中可能含有纯化合物。斑点颜色越深表明所含对应化合物的量越多。第二，根据Rf值或斑点高度判断不同管中是否含有相同的化合物。在同一高度具有相同斑点，表明两管含有相同的成分。B7到C10部分经TLC检测含有大量的绿原酸，这些部分合并浓缩至干后得绿原酸粗品（E）。③精制。将绿原酸粗品再经硅胶柱层析，氯仿-甲醇梯度洗脱，得单一化合物（F），即为绿原酸精品（0.85g）。

3.检测。对E和F两部分分别进行高效液相色谱分析。分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5～10μL，注入液相色谱仪，检测两部分的绿原酸含量。测定条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂以乙腈-0.4%磷酸（13：87）为流动相，SPD-10AV紫外检测器λ327nm下检测。E含绿原酸75%左右，F含绿原酸98%以上。

四、教改效果

上述实验内容需要16学时，要求学生在两天的时间内完成，期间许多操作技术交叉进行，大大提高了实验效率，使学生在系统地掌握固体中有效成分的提取（索氏法）技术、减压浓缩（旋转蒸发）技术、紫外检测技术以及硅胶吸附柱层析、硅胶吸附薄层层析和高效液相色谱现代分离技术实验技能的同时，亲身体验了现代分离技术在天然产物研究中的重要作用，收到了预期的效果。

参考文献：

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基金项目：陕西省教学改革重点攻关项目（11BG05），西北农林科技大学2011年校级教学改革研究项目（JY1101012，JY1102115）。

作者简介：汪玉秀，女，副教授，主要研究方向：植物资源化学。