时间：2023-03-06 03:07:59
随着分子生物学等相关学科的迅猛发展，人们从细胞水平、分子水平对心肌收缩-舒张过程及其调节的诸多参与成分各自的作用及相互间作用有了更进一步的了解和认识。近十几年来，人们针对糖尿病、甲状腺功能异常(包括功能亢进和低下)、心肌肥厚、心肌病、缺氧等病理条件下引起的心功能改变，特别是收缩蛋白、调节蛋白与心功能的关系做了大量深入细致的工作。
1 收缩蛋白和调节蛋白
收缩蛋白包括肌球蛋白和肌动蛋白。肌球蛋白是由学者Kuhne于1859年首先报道的，半个多世纪之后，对肌球蛋白的生化分析才开始进行。肌球蛋白是心肌粗肌丝的主要成分，分子呈杆状，一端具有两个球形区域，似豆芽的头部，由两条重链(MHC)和两对轻链(MLC)构成，是肌球蛋白重要生物活性所在地，另一端是一个丝状“尾巴”，由两股α-螺旋肽链绞在一起形成一种盘卷螺旋结构［1］。肌球蛋白具有二个生物学作用：一是具有ATP酶活性，能裂解ATP，释放化学能；二是具有与肌动蛋白结合的能力。研究表明心脏的MHC是由两种基因编码，即α-MHC和β-MHC基因，这些基因产物在肌球蛋白分子中形成二聚体，所以相应的有三种分子异构体存在，即V1(α、α同源体)、V2(α、β异源体)、V3(β、β同源体)。由于α、β-MHCATP酶活性不同，因此不同的异构体之间所具有的ATP酶活性及收缩活性也不同。肌球蛋白ATP酶活性主要由心肌所含V1或V3的量多少而决定，故肌球蛋白以V1占优势的心肌ATP酶活性最高，肌肉收缩速率最快，耗能也最多，而以V3占优势的心肌情况正相反，以V2占优势的心肌表现介于两者之间［2，3］。肌球蛋白异构体之间的转换是心肌的适应性改变，是心脏本身负荷和能量供应两方面调节适应的结果。V1通过增加心肌收缩速度来增加供能达到能量供求平衡，V3通过减少耗能而适应压力超负荷。当能量供不应求时，肌球蛋白异构体向V3转化，使ATP酶活性下降，心肌收缩功能降低，表现为Vmax下降，最大张力正常，而达到最大张力的时间延长，心肌作功时耗氧量下降，结果使心脏在节能的情况下产生同样的张力，所以V3增加虽可使心肌速度变慢但是却提高了机械效率。
正常哺乳动物和人的心室肌球蛋白异构体的分布与种属、年龄等因素有关。成年人左心室心肌肌球蛋白以V3为主占60%～90%，而小哺乳类动物左心室心肌肌球蛋白以V1为主占60%～90%，人类和哺乳类小动物心房肌球蛋白以V1为主［4］。
对心肌肥厚等病理状态研究显示，心脏肌球蛋白基因表达及蛋白异构中存在着可塑性，推测这可能是动物机体的一种适应反应，例如超负荷刺激引起大鼠心肌肥厚可诱导左心室β-MHC基因表达及V3肌球蛋白增多，结果使心肌耗氧降低，收缩速率下降，被认为是一种经济的适应性反应［5］。
与肌球蛋白相比，肌动蛋白结构及功能相对简单。分子单体为球形，单体上有与肌球蛋白头相结合的位点，许多单体相互连接形成两条有极性的相互缠绕螺旋体。
调节蛋白包括原肌球蛋白(Tm)和肌钙蛋白(Tn)，Tm和Tn结合钙离子构成调节蛋白复合物，通过影响肌动蛋白和肌球蛋白之间的相互作用调节收缩活动［6］。Tm分子由二条完全相同或不同的螺旋形肽链组成(同源或异源二聚体)，不同组织来源(如房、室)和特殊种类的Tm不尽相同。Tn由三种亚单位组成，即TnI、TnT、TnC。TnI是肌动球蛋白复合物的Tn抑制形，具有调节肌动蛋白和肌球蛋白相互作用的能力，这种调节作用主要是一种抑制作用。TnT即肌钙蛋白结合原肌球蛋白，其作用是将肌钙蛋白复合体附着在Tm上。TnC即钙结合肌钙蛋白，是钙离子的受体，具有两个高亲和力和两个低亲和力的钙离子结合点。这三种肌钙蛋白亚型以协同方式相互之间与Tm及肌动蛋白互相作用［7］。
2 病理条件肌球蛋白的改变
2.1 机械性作用
利用乳鼠分离培养的心肌细胞，在体外进行机械牵张与心肌肥厚的实验研究表明，机械牵张引起大鼠心肌细胞MHCmRNA表达增高。Shyu等人［8］用Northernblot分析研究了分离培 养的乳鼠心肌细胞周期性牵张对MHCmRNA表达的影响，与对照组相比显示在不同时相点MHCmRNA最高增加了12倍。Vandenburgh等人［9］研究证实机械作用增加MHC含量，包括β-MHC和α-MHC都增加。Kojima等人［10］在自发性高血压(SHRs)动物模型研究中看到从9周龄到25周龄经vehicle治疗组的SHRs，MHCV3异构体进行性增加。
2.2 限制饮食、缺氧
限制饮食使大鼠心肌V3肌球蛋白异构体增高［11］，早已被人们所认识［12］，这些改变被认为由血中T3水平降低而触发［13］，而最近一些研究显示限制饮食使β-MHC增高并无循环T3的明显改变［12］，Pissarek等也得出相同的结果。但Swoap等认为这不能排除由于心脏甲状腺激素受体的减少而引起一个功能性高甲状腺素的可能性［14］。Pissarek等在慢性低氧(CHH)大鼠模型研究中发现大鼠左、右心室都有一个明显的α-MHC向β-MHC的转换。慢性缺氧引起心肌收缩器(Apparatus)实质性变化，V3肌球蛋白异构体的表达使得心脏降低收缩耗能，提高工作效率［15］。
3 几种疾病状态下肌球蛋白及调节蛋白改变
3.1 糖尿病
糖尿病是许多常见的慢性病之一，它与心血管疾病引起的死亡有较密切的关系。其心功能的破坏不依赖于血管性疾病，提示在糖尿病存在一个原发的心肌的缺陷。大量动物实验研究提示慢性糖尿病动物心功能改变与收缩蛋白ATP酶活性受抑制及肌浆网(SR)和肌膜(SL)钙运输异常有关，这些异常经胰岛素治疗都能逆转。另外用钙通道阻滞剂维拉帕米治疗，心脏收缩蛋白ATP酶活性及肌浆网钙离子活性得到改善［16～18］。进一步研究显示慢性糖尿病动物心脏肌球蛋白异构体-βMHC与ATP酶活性降低和收缩速率(Shortingvelocity)密切相关［19］。
在STZ(Streptozotocin)糖尿病大鼠心肌力学和肌球蛋白酶学研究中，Takeda等人报道了糖尿病影响心肌收缩，肌球蛋白V1向V3转换及心脏能量学的变化。与心肌肌球蛋白以β形占优势相比较，肌球蛋白以α重链占优势的心肌表现收缩速率增加，高ATP酶活性，收缩能量消耗也增加。
在啮齿动物心脏一些病理条件下如高血压心肌肥厚、糖尿病、心肌梗死及老龄心肌，肌球蛋白异构体也显示出明显的转换。糖尿病心脏收缩速率的降低也许可用大鼠模型中肌球蛋白异构体的变化得到部分或全部解释［20］。
成年人心室肌球蛋白以V3异构体占优势，所以这也许是严重病理状态下人类心脏中并没有观察到肌球蛋白ATP酶活性变化的原因，但观察到肌纤维ATP酶曲线下降，推测病理状态下微小差异可能存在于人类肌球蛋白重链，这种差异用一个范围的焦磷酸盐凝胶电泳往往观察不到。故认为非常小的异构酶(Isoenzyme)转换与收缩蛋白的其它主要改变一起可能导致肌纤维活性的明显变化［21］。
除了收缩蛋白，调节蛋白及钙离子因素也直接或间接影响心脏的功能。在脊椎动物的横纹肌，细肌丝的调节成分TnTm负责传导收缩蛋白活动中钙离子效应，并且当钙离子缺乏时则抑制这种活动［22］。人们通过对照组或糖尿病组调节复合物TnTm存在的条件下利用对照组或糖尿病组肌球蛋白观察Ca2+依赖性心脏肌动球蛋白ATP酶活性。当糖尿病大鼠心脏的肌球蛋白被从对照组心脏分离的调节蛋白复合物调节时，肌球蛋白ATP酶可以部分逆转，提示糖尿病大鼠病理模型中调节蛋白能部分上调心脏的肌球蛋白［23］。在SDS平板凝胶中，来自慢性糖尿病大鼠和对照组动物心脏的调节蛋白在TnI和TnT表现不同，加了对照组动物TnTm的糖尿病心脏被调节的肌动球蛋白ATP酶活性发生逆转，这可能说明糖尿病心肌病理中或TnTm亚单位出现的量不同或存在调节蛋白亚单位异构酶组成不同。另外来自糖尿病心脏的调节复合物被重组，导致心脏肌动球蛋白系统调节中钙敏感性下降［24］。而对来自正常的和疾病的人类心肌完整的和分离的心肌中PKC活性作用的一些研究中，Gwathmey和Hajjar报道了肌丝的Ca2+敏感性和收缩活性的改变可能是由TnI和TnT磷酸化所致［25］。也有报道肌球蛋白轻链-2(MLC-2)与PKC的直接磷酸化或PKC的受体介导的刺激物都分别可以导致去膜的［skinned］心肌细胞和肌纤维中Ca2+敏 感性和ATP酶活性的增加［26］。
3.2 甲状腺功能亢进或低下
心脏是甲状腺激素作用的一个主要靶器官，激素水平过高或过低时都明显影响心脏功能。T3对心脏功能的影响是通过它对心脏的直接作用和间接作用。直接作用指T3对心脏细胞的直接效应，是通过核或核外机制介导的。核外T3效应：它的发生不依赖与核T3受体的结合，增加蛋白质合成，主要影响氨基酸、糖及钙离子的穿膜运输；核的T3效应：通过T3与特殊的核受体蛋白结合而被介导，导致T3反应性心脏基因转录增加，另外T3对肌膜(SL)Ca2+a-ATP酶也存在核外效应，引起钙离子从肌细胞流出增加。甲状腺激素对蛋白合成的效应使总体心脏蛋白形成增加，并且增加特殊蛋白的合成率，这种增加远远超过了由甲状腺激素诱导的蛋白合成的一般性增加。对其它一些特殊的蛋白象肌球蛋白重链(MHC)β合成率是降低的，使肌球蛋白V1异构体增加，V3降低，心肌收缩速率增加，ATP消耗也增加。间接作用是T3引起外周改变进一步导致血液动力学变化而影响心功能［27～29］，甲亢时，T3除了增加V1肌球蛋白异构体，也增加心肌的舒张率，被认为与肌浆网(SR)的Ca2+-ATP酶泵的活性有关。有学者报道T3诱导增加了SRCa2+-ATP酶(SERCA2)基因的转录使SERCA2mRNA水平增加［30］。SERCA2是一个离子泵，负责舒张期将胞浆中的钙离子运回到肌浆网。V1肌球蛋白异构体和SERCA2泵数量增加导致甲亢时心脏ATP消耗明显增加，另外ATP化学能少部分用于心肌收缩过程，大部分用于产生热量，降低了心脏的收缩效率［31］。
甲状腺功能低下时情况正相反。T3缺乏在成年啮齿类动物心脏观察到肌球蛋白异构体V1向V3转换，SERCA2活性降低。由此而引起心脏收缩率，代谢等方面的改变在此不再赘述。
总之在病理条件下，肌球蛋白异构体明显转化，肌球蛋白由V1向V3转化，引起心肌收缩力下降，收缩速度变慢。耗氧降低被认为是心肌的一种适应性反应。另外调节蛋白，SERCA2等结构的改变从不同作用环节影响心脏的功能。
参考文献
1 Pelouch V. Molecular aspects of regulation of cardiac contracti on. Physiol Res,1995,44(1):53
2 Pope B, Hoh J F, Weeds A. The ATPase activities of rat cardiac myosin i soenzymes. FEBS lett,1980,118(2):205
3 Swynghedauw B. Developmental and functional adaptation of contractile p roteins in cardiac and skeletal muscles. Physiol Rev,1986,66(3):710
4 Lompre A M, Nadal-Ginard B, Mahdavi V. Expression of the cardiac ventr icular α and β myosin heavy chain genes in developmentally and hormonally regu lated. J Biol Chem,1984,259(10):6437
5 Izumo S, lompre A M, Matsuoka R, et al. Myosin heavy chain messenge r RNA and protein isoform transitions during cardiac hypertrophy interaction between hemodynamic and thyroid hormone-induced signals. J Clin Invest,1987,79 (3):970
6 Mayer N J, Rubin S A. Molecular and cellular prospects for repair,augme ntation,and replacement of the failing heart. Am Heart J,1997,134(3):577
7 Humphreys J. E, Cummins P. Regulatory proteins of the myocardium,atrial and ventricular tropomyosin and troponin-I in the developing andbovine and human heart. J Mol Cell Cardiol,1984,16(7):643
8 Shyu K G, Chen J J, Shih N J, et al. Regulation of human cardiac my osin heavy chain genes by cyclical mechanical stretch in cultured cardiocytes. B iochem Biophys Res Commun.16,1995,210(2):567
9 Vandenburgh H H, Solerssi R, Shansky J, et al. Mechanical stimulati on of organogenic cardiomyocyte growth in vitro. Am J Physiol,1996,270(5): 1284
10 Kojima M，Shiojima I, yamazaki T, et al. Angiotensin Ⅱ re ceptor antagonist TCV-116 induces regression of hypertensive left ventricular h ypertrophy in vivo and inhibits the intracellular signaling pathway of stret ch-mediated cardiomyocyte hypertrophy in vitro. Circulation,1994,89(5):2204
11 Haddad F, Bodell P W, Mccue S A, et al. Food restriction-induc ed transformation in cardiac functional and biochemical properties in rats. J Ap pl physiol,1993,74(2):606
12 Swoap S J, Haddad F, Bodell P, et al. Control of β-myosin heavy chain expression in systemic hypertension and caloric restriction in the rat he art. am J Physiol,1995,269(4 Pt 1):1025
13 Morris G S, Herrick R E, Balduin K M. Dietary carbohydrates modify ca rdiac myosin isoenzyme profiles of semistarved rats. Am J Physiol,1989,256(Regul atory integrative Comp Physiol 25):976
14 Swoap S J, Haddad F, Bodell P, et al. Effect of chronic energy d eprivation on cardiac thyroid hormone receptor and myosin isoform expression. Am J physiol,1994,166(Endocrinol. Metab.29):254
15 Pissarek M, Bigard X, Mateo P, et al. Adaptation of cardiac myo sin and creatine kinase to chronic hypoxia: role of anorexia and hypertension Am J physiol,1997 ,272(4 pt 2):1690
16 Malhotra A, Sanghi V. Regulation of contractile proteins in diabetic h eart. cardiovasc Res,1997,34(1):34
17 Rosen P, Pogatsa G, Tachope D, et al. Diabetic cardiomyopathy: pat hophysiologic concepts and therapeutic approaches. Klin Wochenschr,1992,69(Suppl29):3
18 Afzal N, Pierce G N, Elimban V, et al. Influence of verapamil on s ome subcellular defects in diabetic cardiomyopathy. Am J Physiol,1989,256(4 Pt 1):453
19 Pierce G N, Dhalla N S. Cardiac myofibrillar ATPase activity in diabet ic rats. J Mol Cell Cardiol,1981,13(12):1063
20 Rupp H, Elimban V, Dhalla N S. Diabetes-like action of intermittent f asting on sarcoplasmic reticulum Ca2+-pump ATPase and myosin isoenzymes c an be prevented by sucrose. Biochem Biophy Res commun.1989,164(1):319
21 Pagani E D, Alonsi A A, Grant A M, et al. Changes in myofibrillar content and Mg2+-ATPase activity in ventri-cular tissues from pa tients with heart failure caused by coronary artery disease,cardiomyopathy,or mi tral valve insufficiency. Circ Res,1998,63(2):380
22 Ebashi S, Nonomura Y, Kohama K, et al. Reg ulation of muscle contra ction by ca ion. Mol Biol Biochem Biophys,1980,32:183
23 Malhotra A, Lopez C, Nakouzi A. Troponin subunits contribute to altere d myosin ATPase activity in diabetic cardiomyopathy. Mol Cell Biochem,1995,151(2):165
24 Gwathmey J K, Hajjar R T. Calcium-activated force in a turkey model o f spontaneous dilated cardiomyopathy. J Mol Cell Cardiol,1992,24(12):1459
25 Noland T A Jr, Kuo J F. Phosphorylation of cardiac myosin light chain 2 by protein kinase C and myosin light chain kinase increases Ca2+-stimul ated actomyosin Mg2+-ATPase activity. Biochem Biophys Res commun,1993,193 (1):254
26 Mylotte K M, Cody V, Davis P, et al. Milrinone and thyroid hormone stimulate myocardial membrane Ca2+-ATPase activity and share structural homologies. Proc Natl Acad Sci USA,1985,82(23):7974
27 Umeda P K, Levin J E, Sinha A M, et al. Molecular anatomy of cardi ac myosin he avy chain genes. In:Emerson C, Fischman D, Nadal-Ginard B, et al, eds. m olecular biology of muscle development, UCLA Symposium on Molecular and cellular Biology New Series,1986,vol.29. New York, Al an R Liss,808
28 Mohr-kahalys, kahaly G, Meyer J: Cardiovascular effects of thyroid ho rmones. Z Kardiol,1996,85(6):219
关键词：肌球蛋白；超高压；凝胶机理
Abstract： High pressure processing （HPP） technology is a non-thermal processing technology that could affect functional properties of meat gel. Myosin， one of the myofibrillar proteins， contributes dominantly to the meat gelation process. Although the effect and underlying mechanism of high pressure processing on meat gelation have been elaborately investigated， knowledge is still lacking as to the complex system consisting of muscle and myofibrillar proteins. Studies focused on the alterations of myosin under high pressure environment might provide us an opportunity to drill down to the details of this complex system and in turn provide a better guidance for practical production. This paper is centered on a review of the progress which has been made in understanding the mechanism of the high pressure induced gelation of myosin as well as technical restrictions for relevant studies. Future prospects are also discussed.
Key words： myosin； high pressure processing； gelation mechanism
DOI：10.15922/ki.rlyj.2016.10.008
中图分类号：TS251.1 文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2016）10-0040-05
引文格式：
薛思雯， 钱畅， 王梦瑶， 等. 肌球蛋白高压凝胶机理的研究进展[J]. 肉类研究， 2016， 30（10）： 40-44. DOI：10.15922/ki.rlyj.2016.10.008. http：//
XUE Siwen， QIAN Chang， WANG Mengyao， et al. Progress in understanding the mechanism of the high pressure-induced gelation of myosin[J]. Meat Research， 2016， 30（10）： 40-44. （in Chinese with English abstract） DOI：10.15922/ki.rlyj.2016.10.008. http：//
肌球蛋白，是肌原纤维蛋白在凝胶形成过程中起最主要作用的蛋白质，对肉类凝胶的功能特性如保水性、保油性、乳化特性等都起决定性作用，它在特定条件下会形成多聚体，在生理条件或者低离子强度条件下是不可溶解的，大部分的肌球蛋白分子在0.5 mol/L氯化钾和20 mmol/L磷酸钾缓冲液中呈单体状态（pH 7.0）[1]。
肌球蛋白分子是形如豆芽状的单体蛋白分子（有头部和尾部），由6 条多肽链组成，分别为2 条重链（myosin heavy chain，MHC）和4 条轻链（light chain，LC），
经胰蛋白酶水解后会形成重酶解肌球蛋白（heavy meromyosin，HMM）和轻酶解肌球蛋白（light meromyosin，LMM）[2]。在肌球蛋白的头部有Ca-ATPase的活性位点，它会随着加热或者加压逐步失活而导致蛋白构象的变化。有研究认为当有50%的Ca-ATPase失去活性时，肌球蛋白就会聚集形成良好的凝胶网络结构[3]。
超高压加工（high pressure processing，HPP）技术是近几十年来兴起的非热加工技术之一，较传统技术而言，其不仅可以有效灭菌、钝酶，还能通过修饰蛋白来改善产品的质构和保油、保水性；同时又不会破坏小分子及共价键，能最大程度地保持产品的风味与色泽[4-5]。随着相应设备的不断开发，该技术已被广泛运用于商业化生产中[6]。
许多学者针对高压处理对肉制品或肌原纤维蛋白的影响做过相应的研究探讨，发现将肉类蛋白质在合适的参数下进行高压处理能够显著改善其加工特性，起促溶、增强乳化、持水以及凝胶能力的效果；更能在不改变或提高其功能特性的前提下达到减少氯化钠或磷酸盐添加量的目的[7-10]，即高压作用会影响盐离子对肌球蛋白分子的修饰作用以及他们之间的相互作用。但同时高压参数的微小变化也会使蛋白质的功能特性呈现出极为显著的变化，对肉类蛋白造成不良的影响从而减弱其功能特性。为最大程度地在肉品加工领域应用超高压技术，需要更深入地研究高压对肌肉或者肌原纤维蛋白体系的作用。而肌球蛋白层面的基础研究有助于对这一复杂体系的深入了解，从而为高压凝胶类肉制品的生产提供理论指导和技术支持。
1 超高压作用于肌球蛋白分子的主要方式
高压对肌球蛋白分子的影响与热处理不同。加热是一个时间较长的过程，在20世纪末，Yamamoto[11]、Sharp[12]等分别利用金属投影透射电镜和负染法透射电镜观察，发现在加热过程中肌球蛋白的头部与头部、尾部与尾部、头部与尾部之间相互作用交联，在非共价键（疏水相互作用、范德华力等）和共价键（二硫键等）作用下形成相互交联的凝胶网络结构。Sharp等[12]更发现温度越高，参与的肌球蛋白分子越多，肌球蛋白形成的聚合体越大，随着温度进一步升高到50 ℃以上，尾部开始变得模糊，形成交联，研究强调肌球蛋白头-头之间的交联形成了球状聚合物，而尾部之间的交联可能才是形成链之间交联和凝胶网络的重要作用。
高压处理是瞬时、均一的作用过程，整个反应体系没有显著的压力梯度变化。当压力作用于蛋白质时，产生的最大影响是蛋白质的体积会被压缩，分子形态会变化以及凝胶形成过程中分子间会形成相互作用，从而发生可逆或不可逆的改变；而这一过程也离不开温度的作用，在升压过程中，压力使得腔体的体积变小，引起腔体内的温度升高；而降压时温度也会随之下降，且温度高低、变化快慢都与升压/降压速率密切相关[13]。因此前人关于肌球蛋白热凝胶的研究也是今后探究高压对肌球蛋白成胶机理的重要基础。但与热变性成胶不同的是，肌球蛋白的高压变性聚集和之后的凝胶形成没有一个统一的模式且高压参数的影响很大；更有许多学者研究指出高压作用下的凝胶和热凝胶机制不同，头部极有可能是关键区域[14-15]。
超高压技术在肉制品中的应用根据参数和与热处理的结合主要分4 种，而其中对肌球蛋白凝胶特性有显著影响的主要是非变性温度下高压处理后热加工以及变性温度下高压处理直接形成凝胶，这2 种工艺分别称为高压辅助凝胶和高压凝胶，两者使蛋白变性以及成胶的影响也不同。Fernández-Martín等[16]的研究便发现非变性温度下高压处理会使肌球蛋白稳定性降低，有利于其进一步变性；而变性温度下高压处理，高压作用反而会保护肌球蛋白分子中的某些天然构象，延迟其变性，继而导致整个体系的变性温度升高，过程减缓。故形成的高压凝胶与单纯的热诱导凝胶相比，保水保油性有较大改善，但凝胶的质构特性有所下降。同时由于高压凝胶所要求的压力水平较高，对设备的要求也更为苛刻，因此从企业效益出发，高压辅助凝胶技术更受青睐，该技术不仅能够有效地改善蛋白质的功能特性（例如可以改善鸡肉中的类PSE肉的功能特性[17]），还能达到减盐、减脂的目的[18]，
更能大幅度提高肉制品的安全性，在肉制品加工行业有广阔的应用前景[19]。
2 高压对肌球蛋白分子的影响
2.1 高压对肌球蛋白分子形态的影响
由于高压辅助凝胶技术能显著地改善肉制品蛋白凝胶的功能特性，且所施加的压力水平一般低于400 MPa，在现有的高压工艺肉制品加工中应用较多，高压作用对于蛋白分子最直观的影响是使其分子形态产生变化。Yamamoto[11]发现，当压力达到140 MPa以上时，溶解于0.5 mol/L KCl、pH 6.0溶液中的肌球蛋白分子开始聚集，而当压力进一步加大到210 MPa时，溶液中大量肌球蛋白分子头部发生聚集，尾部向外分散，形成轮状的分子簇结构；且有部分肌球蛋白分子经高压处理后会丢失一个头部结构。Sikes等[20]发现对牛肉加热前高压处理可以增加肌球蛋白的溶解性促进黏结，同时使分子部分解折叠；这有助于在后续的加热过程中形成良好的蛋白凝胶，从而降低生产过程中食盐和磷酸盐的添加量，这和Crehan等[21]的研究结果一致。Iwasaki等[22]发现200 MPa以上压力处理会压缩肌球蛋白分子的体积，从而使凝胶强度和表面弹性下降。Simonin[14]、Sun[15]等研究发现，高压辅助凝胶工艺会改变肌球蛋白的变性机制。在非变性温度下高压处理，肌球蛋白分子会先解聚，这不仅可增加肌球蛋白的溶解，还会破坏其头部肌动蛋白和ATP结合位点的天然构象，这些变化在很大程度上都会影响其热凝胶的性质。
2.2 高压对肌球蛋白间化学作用力的影响
Hsu等[23]的研究发现，在高压处理的过程中，蛋白质的流变特性和热动力特性逐步转变；高压下蛋白质分子的聚集和胶凝现象主要是活性巯基被氧化后形成分子间和分子内二硫键，蛋白发生变性形成交联引起的，这与Yamamoto[11]的研究结果一致。通过比较，Ko等[24]认为肌球蛋白经150 MPa高压处理后加热可以形成有强度和弹性的凝胶网络结构，而其中发挥主要作用的是分子间疏水作用力和二硫键。但同时也有研究指出，非变性温度下高压处理会保护或增强氢键，从而稳定肌球蛋白分子内部一部分天然构象[25]。
Cao等[26]将兔肌球蛋白溶液在100～400 MPa、20 ℃条件下保压10 min，通过测定高压处理后蛋白溶液的表面疏水性、巯基含量、动态流变等指标，并结合活性电泳图谱分析，发现在100～200 MPa条件下，肌球蛋白溶液的表面疏水性和活性巯基含量略有升高，但是当压力到达300～400 MPa时，这两者含量显著增加，动态流变结构显示肌球蛋白溶液（20 mg/mL）在400 MPa压力作用下会形成凝胶。他们认为高压诱导肌球蛋白变性成胶的机制可主要概括为压力作用下肌球蛋白解折叠，暴露出疏水基团和包埋的巯基基团，当压力进一步升高时，压力、温度和氧化剂的共同作用使巯基氧化成二硫键以及疏水相互作用形成，肌球蛋白分子进一步变性、聚集，最终连结成凝胶网络结构。
多位学者的研究结果还表明，不同物种来源的肌球蛋白对高压的敏感性也有差异，如鱼类的肌球蛋白一般在150 MPa的压力作用下就能发生变性，而畜禽类的肌球蛋白分子需要在200 MPa以上的压力作用下才能观察到其对凝胶形成的影响[17，27-31]。但到目前为止，大部分研究都认为，高压作用主要通过影响肌球蛋白分子的表面疏水性及二硫键（凝胶形成过程中最重要的2 种化学作用力）的形成，进而抑制或促进蛋白凝胶网络的形成。
2.3 高压对肌球蛋白形成的凝胶网络结构的影响
肌球蛋白凝胶的功能特性受其所处的环境（离子浓度、溶液体系中的添加物等）以及成胶处理（加热或加压）影响。高压处理通过外部施加的作用力使肌球蛋白分子发生变性与聚集，而聚集的蛋白簇进一步相互交联形成凝胶网络。和热处理相似，高压处理也需要达到一定的压强才能使肌球蛋白充分变性、聚集、交联[32-34]。因此，不同高压参数下处理后肌球蛋白间的相互作用以及凝胶结构是存在差异的。
Yamamoto[11]对兔骨骼肌肌球蛋白进行210 MPa高压处理后，利用旋转阴影透射电镜观察发现虽然肌球蛋白头部形成聚集，但是无凝胶网络结构形成，需要进一步加热，且加热后的凝胶微结构与未经高压诱导的凝胶网络微结构没有显著差异。也有研究发现，在低离子浓度条件下，将肌球蛋白先高压处理再线性升温所形成凝胶的强度较未经高压处理组的更大，且与肌球蛋白纤丝的长度呈正相关关系[35-36]。
Cao等[26]通过分析扫描电镜结果发现，在200 MPa以下的压力作用下形成的凝胶呈纤丝结构并有许多小的空洞，当压力达到300 MPa时，凝胶开始形成球形聚集并伴随有大的空洞出现，再升高压力到400 MPa时形成的空洞变大，球状聚积物出现，肌球蛋白分子之间的交联减少，活性电泳的结果表明肌球蛋白在400 MPa压力下已经发生变性。但目前的研究中鲜有关于更高压力（>500 MPa）作用下肌球蛋白形成的凝胶网络微结构的研究。
2.4 高压对肌球蛋白分子结构的影响
拉曼光谱法、傅里叶变换红外光谱法、圆二色谱法、荧光探针法都是研究蛋白二级、三级结构的常用方法。Huppertz等[37]发现在整个高压处理过程中，蛋白质的空间结构都会受到不同程度的影响，如150 MPa高压处理会破坏蛋白多聚体之间的非共价键，影响蛋白质的高级结构；压力大于200 MPa时，维持蛋白三级结构的疏水作用力和离子键遭破坏，这些均会导致蛋白的三维凝胶网络结构在进一步的加热过程中改变，进而引起蛋白凝胶的功能特性变化。这与Yamamoto等[38]的发现一致。King等[39]将鸡骨骼肌肌球蛋白进行酶解，以其杆状部分和杆状纤丝部分为研究对象，利用荧光探针法和圆二色谱法研究发现43～49 MPa的压力可以使杆状纤丝部分（0.4 mg/mL）发生中等程度的分解，但是杆状部位的2 条螺旋链则要在更高的压力条件（约130 MPa）下才会解离，杆状部位的2 条α螺旋链的分子内相互作用比杆状纤丝部分的分子间相互作用更稳定。
Iwasaki等[40]利用ANS荧光探针法研究肌球蛋白以及其次结构（S-1和杆状部位）在高压作用下分子结构的变化。实验发现，在400 MPa下肌球蛋白的内荧光光谱会发生4 nm的红移，且ANS荧光强度随着压力的增加而变大；肌球蛋白及其次结构的内荧光光谱的变化经量化后表达为质谱中心，该质谱中心与压力的大小呈线性正相关关系；但ANS标记的杆状部分的荧光强度却没有随压力水平的变化而改变；压力大于300 MPa时S-1部分的质谱中心出现滞后现象，在压力高于350 MPa时该现象更加明显。在高于350 MPa的压缩过程中，质谱中心并没有减小，表明S-1部分在高于350 MPa时部分变性且保持稳定；直到400 MPa时，S-1部分相应荧光强度的变化仍能检测到，并且会随着压力的增加而增加，但在压力释放后却没有改变。ANS荧光强度在恒定压力下增加意味着压力诱导的肌球蛋白的变性在升压过程中加速。内荧光和ANS分子荧光强度的检测结果表明，肌球蛋白的头部和尾部对高压的敏感程度不同，在肌球蛋白头部，色氨酸残基的极性增加，疏水内芯暴露到分子表面，相比之下尾部的多肽链结构只有部分发生变性。故对高压最敏感的部分是肌球蛋白的头部，这些也符合Ko等[24]将肌球蛋白酶解为头部S-1和尾部Rod，再经高压处理后发现S-1解聚交联并成胶。而Rod并无太大变化的结果[20]。
这些研究结果均表明，较低压力水平（
3 结 语
肌球蛋白形成高压凝胶是一个复杂的动力学过程，包括蛋白构象、化学作用力、分子形态等各个方面的综合作用。另外，肌球蛋白的高压辅助凝胶和高压凝胶的成胶机制不尽相同，形成凝胶的作用力也有所差异，而今受研究设备和方法的局限，高压凝胶过程的肌球蛋白变化还没有得到充分彻底的研究。虽然超高压技术目前已经日趋成熟，在肉类工业中的应用也日渐广泛，但仍需从理论角度去诠释肌球蛋白在超高压作用下变化的动力学过程，才能更深入地研究高压作用对肌肉、肉糜以及肌原纤维蛋白等复杂体系的影响，真正使科学基础研究造福肉类工业，减少生产浪费，提高产品品质，研发新型肉制品。因此，如何在现有技术的基础上研究不同高压条件处理下肌球蛋白的变化将是相关科研人员的挑战。
参考文献：
[1] LIU M N， FOEGEDING E A. Thermally induced gelation of chicken myosin isoforms[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 1996， 44（6）： 1441-1446. DOI：10.1021/jf950341.
[2] SMYTH A B， SMITH D M， O’NEILL E. Disulfide bonds influence the heat-induced gel properties of chicken breast muscle myosin[J]. Journal of Food Science， 1998， 63（4）： 584-587. DOI：10.1111/j.1365-2621.1998.tb15790.x.
[3] JAO C L， HWANG J S， KO W C， et al. A kinetic study on inactivation of tilapia myosin Ca-ATPase induced by high hydrostatic pressure[J]. Food Chemistry， 2007， 101（1）： 65-69. DOI：10.1016/j.foodchem.2005.11.051.
[4] HEINZ V， BUCKOW R. Food preservation by high pressure[J]. Journal Für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit， 2010， 5（1）： 73-81. DOI：10.1007/s00003-009-0311-x.
[5] GIM?NEZ B， GRAIVER N， CALIFANO A， et al. Physicochemical characteristics and quality parameters of a beef product subjected to chemical preservatives and high hydrostatic pressure[J]. Meat Science， 2015， 100： 179-188. DOI：10.1016/j.meatsci.2014.10.017.
[6] CHAMORRO A， MIRANDA F J， RUBIO S， et al. Innovations and trends in meat consumption： an application of the delphi method in Spain[J]. Meat Science， 2012， 92（4）： 816-822. DOI：10.1016/j.meatsci.2012.07.007.
[7] KAUR B P， KAUSHIK N， RAO P S， et al. Effect of high-pressure processing on physical， biochemical， and microbiological characteristics of black tiger shrimp （Penaeus monodon）[J]. Food and Bioprocess Technology， 2013， 6（6）： 1390-1400. DOI：10.1007/s11947-012-0870-1.
[8] MARCHETTI L， ARGEL N， ANDR?S S C， et al. Sodium-reduced lean sausages with fish oil optimized by a mixture design approach[J]. Meat Science， 2015， 10（4）： 67-77. DOI：10.1016/j.meatsci.2015.02.005.
[9] O’FLYNN C C， CRUZ-ROMERO M C， TROY D J， et al. The application of high-pressure treatment in the reduction of salt levels in reduced-phosphate breakfast sausages[J]. Meat Science， 2014， 96（3）： 1266-1274. DOI：10.1016/j.meatsci.2013.11.010.
[10] O’FLYNN C C， CRUZ-ROMERO M C， TROY D J， et al. The application of high-pressure treatment in the reduction of phosphate levels in breakfast sausages[J]. Meat Science， 2014， 96（1）：633-639. DOI：10.1016/j.meatsci.2013.08.028.
[11] YAMAMOTO K. Electron microscopy of thermal aggregation of myosin[J]. Journal of Biochemistry， 1990， 108（6）： 896-898.
[12] SHARP A， OFFER G. The mechanism of formation of gels from myosin molecules[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture， 1992， 58（1）： 63-73. DOI：10.1002/jsfa.2740580112.
[13] YALDAGARD M， MORTAZAVI S A， TABATABAIEF. The principles of ultra-high pressure technology and its application in food processing/preservation： a review of microbiological and quality aspects[J]. African Journal of Biotechnology， 2008， 7（16）： 2739-2767.
[14] SIMONIN H， DURANTON F， LAMBALLERIE M D. New insights into the high-pressure processing of meat and meat products[J]. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety， 2012， 11（3）： 285-306. DOI：10.1111/j.1541-4337.2012.00184.x.
[15] SUN X D， HOLLEY R A. High hydrostatic pressure effects on the texture of meat and meat products[J]. Journal of Food Science， 2010， 75（1）： R17-R23. DOI：10.1111/j.1750-3841.2009.01449.x.
[16] FERN?NDEZ-MART?N F， FERN?NDEZ P， CARBALLO J， et al. Pressure/heat combinations on pork meat batters： protein thermal behavior and product rheological properties[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 1997， 45（11）： 4440-4445. DOI：10.1021/jf9702297.
[17] CHAN J T Y， OMANA D A， BETTI M. Application of high pressure processing to improve the functional properties of pale， soft， and exudative （PSE）-like turkey meat[J]. Innovative Food Science and Emerging Technologies， 2011， 3（12）： 216-225. DOI：10.1016/j.ifset.2011.03.004.
[18] OMANA D A， PLASTOW G， BETTI M. The use of β-glucan as a partial salt replacer in high pressure processed chicken breast meat[J]. Food Chemistry， 2011， 129（3）： 768-776. DOI：10.1016/j.foodchem.2011.05.018.
[19] HUGAS M， GARRIGA M， MONFORT J M. New mild technologies in meat processing： high pressure as a model technology[J]. Meat Science， 2002， 62（3）： 359-371. DOI：10.1016/S0309-1740（02）00122-5.
[20] SIKES A K， TUME R K. Effect of processing temperature on tenderness， colour and yield of beef steaks subjected to high-hydrostatic pressure[J]. Meat Science， 2014， 97（2）： 244-248. DOI：10.1016/j.meatsci.2013.12.007.
[21] CREHAN C M， TROY D J， BUCKLEY D J. Effects of salt level and high hydrostatic pressure processing on frankfurters formulated with 1.5 and 2.5% salt[J]. Meat Science， 2000， 55（1）： 123-130. DOI：10.1016/S0309-1740（99）00134-5.
[22] IWASAKI T， NOSHIROYA K， SAITOH N， et al. Studies of the effect of hydrostatic pressure pretreatment on thermal gelation of chicken myofibrils and pork meat patty[J]. Food Chemistry， 2006， 95（3）： 474-483. DOI：10.1016/j.foodchem.2005.01.024.
[23] HSU K C， KO W C. Effect of hydrostatic pressure on aggregation and viscoelastic properties of tilapia （Orechromis niloticus） myosin[J]. Journal of Food Science， 2001， 66（8）： 1158-1162. DOI：10.1111/j.1365-2621.2001.tb16098.x.
[24] KO W C， JAO C L， HSU K C. Effect of hydrostatic pressure on molecular conformation of tilapia （Orechromis niloticus） myosin[J]. Journal of Food Science， 2003， 68（4）： 1192-1195. DOI：10.1111/j.1365-2621.2003.tb09623.x.
[25] CARBALLO J， COFRADES S， SOLAS M T， et al. High pressure/thermal treatment of meat batters prepared from freeze-thawed pork[J]. Meat Science， 2000， 54（4）： 357-364. DOI：10.1016/S0309-1740（99）00110-2.
[26] CAO Y， XIA T， ZHOU G， et al. The mechanism of high pressure-induced gels of rabbit myosin[J]. Innovative Food Science and Emerging Technologies， 2012， 12（3）：1641-46. DOI：10.1016/j.ifset.2012.04.005.
[27] ZHU Z， LANIER T C， FARKAS B E， et al. Transglutaminase and high pressure effects on heat-induced gelation of Alaska pollock （Theragra chalcogramma） surimi[J]. Journal of Food Engineering， 2014， 13（1）： 154-160. DOI：10.1016/j.jfoodeng.2014.01.022.
[28] ZHOU A， LIN L， LIANG Y， et al. Physicochemical properties of natural actomyosin from threadfin bream （Nemipterus spp.） induced by high hydrostatic pressure[J]. Food Chemistry， 2014， 15（6）： 402-407. DOI：10.1016/j.foodchem.2014.02.013.
[29] PAZOS M， M?NDEZ L， GALLARDO J M， et al. Selective-targeted effect of high-pressure processing on proteins related to quality： a proteomics evidence in Atlantic Mackerel （Scomber scombrus）[J].
Food and Bioprocess Technology， 2014， 7（8）： 2342-2353. DOI：10.1007/s11947-013-1250-1.
[30] MARCOS B， MULLEN A M. High pressure induced changes in beef muscle proteome： correlation with quality parameters[J]. Meat Science， 2014， 97（1）： 11-20. DOI：10.1016/j.meatsci.2013.12.008
[31] BOLUMAR T， ANDERSEN M L， ORLIEN V. Mechanisms of radical formation in beef and chicken meat during high pressure processing evaluated by electron spin resonance detection and the addition of antioxidants[J]. Food Chemistry， 2014， 15（6）： 422-428. DOI：10.1016/j.foodchem.2013.10.161.
[32] CHEN X， CHEN C， ZHOU Y， et al. Effects of high pressure processing on the thermal gelling properties of chicken breast myosin containing κ-carrageenan[J]. Food Hydrocolloids， 2014， 40（2）： 262-272. DOI：10.1016/j.foodhyd.2014.03.018.
[33] TINTCHEV F， BINDRICH U， TOEPFL S， et al. High hydrostatic pressure/temperature modeling of frankfurter batters[J]. Meat Science， 2013， 94（3）： 376-387. DOI：10.1016/j.meatsci.2013.02.012.
[34] BUCKOW R， SIKES A， TUME R. Effect of high pressure on physicochemical properties of meat[J]. Critical Reviews in Food Science and Nutrition， 2013， 53（7）： 770-786. DOI：10.1080/10408398.2011.560296.
[35] ISHIOROSHI M， JIMAK S， YASUI T. Heat-induced gelation of myosin： factors of pH and salt concentrations[J]. Journal of Food Science， 1979， 44（5）： 1280-1284. DOI：10.1111/j.1365-2621.1979.tb06419.x.
[36] YAMAMOTO K， SAMEJIMA K， YASUII T. Heat-induced gelation of myosin filaments[J]. Agricultural and Biological Chemistry， 1988， 52（7）： 1803-1811. DOI：10.1271/bbb1961.52.1803.
[37] HUPPERTZ T， FOX P F， KELLY A L. High pressure treatment of bovine milk： effects on casein micelles and whey proteins[J]. Journal of Dairy Research， 2004， 71（1）： 97-106. DOI：10.1017/S002202990300640X.
[38] YAMAMOTO K， HAYASHI S， YASUI T. Hydrostatic pressure-induced aggregation of myosin molecules in 0.5 M KCl at pH 6.0[J]. Bioscience Biotechnology and Biochemistry， 1993， 57（3）： 383-389. DOI：10.1271/bbb.57.383.
[39] KING L， LIU C C， LEE R F. Pressure effects and thermal stability of myosin rods and rod minifilaments： fluorescence and circular dichroism studies[J]. Biochemistry， 1994， 33（18）： 5570-5580. DOI：10.1021/bi00184a028.
关键词：肌球蛋白重链；低氧；低氧运动
中图分类号：G804.2文献标识码：A文章编号：1007-3612(2008)07-0919-03
低氧环境已显示可引起骨骼肌形态学显著的改变，如毛细血管密度增加、平均肌纤维横截面积下降，同时线粒体数目、肌红蛋白明显增多，机体的有氧代谢能力得到改善。
伴随着代谢方式等一系列的改变肌纤维类型也可能会发生相应的调整。如Itoh［1］的研究表明雄性SD鼠置于模拟4 000 m低氧舱10周后，比目鱼肌快缩氧化糖酵解型肌纤维（FOG）增加，慢缩氧化型纤维（SO）减少；Bigard等对Wistar鼠4 000 m高度游泳训练14周的研究［2］显示，高海拔耐力练习引起快肌趾长伸肌（Extensor digitorum longus，EDL）和足底肌（Plantaris，PLA）Ⅱa型纤维增加，同时Ⅱb减少。
由于肌纤维分类方法的差异使得对于低氧及低氧耐力训练影响肌纤维组成的报道结果存在差异。现在常用的肌纤维分类方法有肌原纤维ATP酶（肌球蛋白ATP酶）、肌球蛋白重链(MHC)单克隆抗体免疫组化、肌球蛋白重链(MHC) 聚丙烯酰胺凝胶电泳等方法。
肌原纤维ATP酶（肌球蛋白ATP酶）的方法一般只能区分出Ⅱa、Ⅱb和Ⅰ三种肌纤维［3］；免疫组化方法由于缺乏特异性的Ⅱx MHC抗体，目前还不能检测到Ⅱa与Ⅱx或Ⅱx与Ⅱb同时存在的纤维类型。肌球蛋白重链(MHC) 聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法可以清晰地看到四种纯合的肌纤维（Ⅱa-MHC、Ⅱb-MHC、Ⅱd/x-MHC和Ⅰ-MHC），依其敏感性好、特异性强、可重复的特点广泛用于分离MHC。
Talmadge［4］总结多人研究结果发现，由MHC确定的肌纤维最大收缩速度顺序为Ⅰ
1材料与方法
1.1实验动物与分组7周龄健康雄性Spraque Dawley(SD)大鼠30只，平均体重(210±20)g，购自河北医科大学实验动物中心，为国家二级卫生动物。饲养温度控制在(22±3)℃，动物自由进水进食，适应性喂养两天后，随机分为三组，每组10只:
常氧对照组（Normoxic Controls,NC）
低氧对照组（Hypoxic Controls,HC）
低氧训练组（Hypoxic Training,HT）
1.2训练方式HC组和HT组动物均生活在模拟海拔4 000 m高度的低氧舱中（氧浓度12.7％），每天至少保证22 h低氧时间。
低氧训练组经5 d跑台适应后，进入正式训练。训练在常氧条件下进行，训练方式为跑台练习：
跑台坡度＋10°，跑速20 m／min，每天1次，每次1 h，每周训练6 d，28 d后取材。
1.3取材腹腔注射戊巴比妥钠麻醉（45 mg/kg），迅速剥离两侧浅层胫前肌，去除结缔组织，锡纸包叠后置于液氮中冻存。
1.4主要测试方法和仪器
1) 骨骼肌肌球蛋白重链(MHC)蛋白组成：
十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳方法（SDS-PAGE）。参照Talmadge(1993)［5］
2） 骨骼肌MHCⅠ、Ⅱa、Ⅱx/d、Ⅱb四个亚型mRNA 基因表达：（RT-PCR方法 ）
低氧设备：HYPOXIC TRAINING SYSTEMS, Hypoxico Inc.(USA)
PCR引物设计：PCR引物由北京奥科生物技术有限责任公司设计、合成。
引物序列如下表：
1.5统计分析
采用SPSS11.5统计软件，利用多因素方差一般线性模型（GLM）LSD方法检验各组间是否有显著性差异，P
2结果
2.1低氧、低氧耐力训练对肌球蛋白重链(MHC)蛋白组成的影响
SDS-PAGE结果如图1所示，依各个亚型不同的电泳迁移速率由上向下依次为Ⅱa、Ⅱx、Ⅱb、Ⅰ。
由图1和表1，慢型MHCⅠ比例不受低氧和低氧训练的影响；低氧、低氧训练均显著降低了Ⅱa比例，其中低氧对照组下降幅度更明显（P
上述结果可以总结为：单纯低氧降低了Ⅱa MHC蛋白表达，取而代之的是Ⅱx和Ⅱb MHC表达升高，即低氧引起“慢型”MHC向“快型”转化；低氧训练的效果与单纯低氧变化趋势一致。
2.2低氧、低氧耐力训练对MHCs mRNA表达的影响
3讨论
3.1低氧、低氧耐力训练对肌球蛋白重链(MHC)蛋白组成的影响肌球蛋白是骨骼肌细胞中表达最多的蛋白，占总蛋白的25％，由两条重链和两对不同的轻链组成。因其具有ATP酶活性，所以又称肌球蛋白Ca2+-ATP酶，肌球蛋白Ca2+-ATP酶活性高低,直接决定肌纤维的收缩力量和速度。
成年骨骼肌有Ⅱa-MHC、Ⅱb-MHC、Ⅱd/x-MHC和Ⅰ-MHC四种类型，由MHC确定的肌纤维最大收缩速度顺序为Ⅰ
目前学者们对低氧的关注很多，但低氧对肌纤维和MHC组成的报道为数并不多，且研究结果也不尽相同。
如Bigard［6］将Wistar鼠置于模拟5 500 m海拔环境中4周，足底肌Ⅰ、Ⅱa型MHC显著下降，Ⅱb MHC增加；比目鱼肌Ⅰ型MHC显著下降，Ⅱa MHC增加。肌纤维转换方向与我们实验一致，一般来说，肌纤维的转换容易发生在快肌纤维间，Ⅰ和Ⅱ型间很难相互转变，Bigard的实验足底肌Ⅰ型MHC向Ⅱ型MHC转换可能由于低氧刺激严重引发的。
多数低氧影响比目鱼肌结果都是Ⅰ型MHC下降，Ⅱa增加，或者SO肌纤维下降同时FOG增加［7］。
尽管上述一些研究显示低氧引起慢型MHC向快型转化，但若形成缺氧不明显MHC和肌纤维组成不会改变。
如Perhonen［8］对于Wistar鼠2 250～2 500 m高度低氧跑台训练观察氧化酶活性增加的同时，体重下降，但肌原纤维ATP酶方法检测的肌纤维组成无明显变化。
低氧影响肌纤维和MHC组成受低氧高度的制约。模拟低氧高度低，造成组织缺氧不足，不能引起肌纤维和MHC改变。
慢性低氧引起肌组织中的氧压水平较低可能是引起肌纤维转化的一个有利因素。低氧一般会使快肌纤维表达增加，这些肌纤维多数在低氧压条件下工作，一方面是由于它们毛细血管供应不足，另一方面它们在高强度练习中易被募集。
慢性持续性低氧与运动引起的低氧不同，前者持续时间久，且造成缺氧程度高，这可能更适于Ⅱb等快肌纤维的表达，Ⅱb肌纤维以糖酵解为主，比氧化型纤维如Ⅰ或Ⅱa更易受局部低氧的影响。
耐力训练是一种增加负荷的训练，有研究报道负荷强度适宜、持续时间足够长的耐力训练会引起快型MHC向慢型转化。如有研究大鼠轮跑4周比目鱼肌Ⅰ型MHC显著增加。SD大鼠75％强度跑台训练10周的实验观察到训练时间大于60 min时比目鱼肌MHCⅠ显著增加，同时MHCⅡa下降［9］。Wistar鼠4周耐力练习（20 m/min,60 min/d,5d／周）［10］结果显示，足底肌MHCⅡb下降的同时MHCⅡa明显增加。
本实验中低氧耐力训练组MHCⅡa下降幅度低于低氧对照组，与此同时MHCⅡb升高幅度同样低于低氧对照组，这可能缘于耐力训练易引起快型MHC向慢型转化。
3.2低氧、低氧耐力训练对MHCs mRNA表达的影响RT-PCR方法测定的各种MHC mRNA是在转录水平观察MHC的变化。转录是蛋白合成的前提，转录水平的变化为蛋白水平的改变提供可能性。
低氧对MHC mRNA的影响表现为MHC－Ⅱa mRNA显著增加，MHC－ⅠmRNA不显著减少。许多关于低氧影响MHC蛋白组成的研究也表明低氧会使慢型MHC向快型转化。低氧影响MHC蛋白的结果显示MHC－Ⅱa向MHC－Ⅱx和MHC－Ⅱb转化，虽然低氧影响MHC蛋白和mRNA表达改变的具体MHC不同，但均显示快型MHC表达的增加。具体MHC不同的原因可能在于mRNA的增加能在刺激的即刻发生，其半衰期约为2～3 d，而相应蛋白的半衰期为2～3周［11］，MHC表型的表达可能是MHCmRNA与蛋白不同时机上调和下调的结果。因而MHC表型表达与MHCmRNA间会出现错配的现象。除此之外，翻译或翻译后机制的调控也妨碍mRNA准确地表达蛋白活性［12-15］。
4结语
低氧及低氧耐力训练作为一种剧烈的缺氧刺激，不仅能增加骨骼肌毛细血管的分布，改善局部血液供应，增加有氧氧化酶活性，还能引起骨骼肌微细结构的改变，本研究显示快型肌球蛋白重链表达增加，基因和蛋白表达均有表现。肌球蛋白是骨骼肌内主要的结构蛋白和收缩蛋白，其组成的改变直接会影响到肌肉的收缩速度、收缩力量及其他代谢特性。此实验必将会对低氧训练的深入研究提供一有益的启示。
参考文献：
［1］ Kazuo Itoh,Toshio Moritani,Koji Ishida,Chiyoko Hirofuji,Sadayoshi Taguchi,and Minoru Itoh. Hypoxia-induced fibre type transformation in rat hindlimb muscles［J］.Eur J Appl Physiol. 1990, 60(5): 331-336.
［2］ A.X.Bigard,A.Brunet,C.Y.Guezennec,and H.Monod.Skeletal muscle changes after endurance training at high altitude［J］.J Appl Physiol. 1991,71(6):2114-2121.
［3］ D.Pette,H.Peuker and R.S.Staron. The impact of biochemical methods for single muscle fibre analysis［J］.Acta Physiol Scand.1999,166(4):261-277.
［4］ Robert J.Talmadge.Myosin heavy chain isoform expression following reduced neuromuscular activity: potential regulatory mechanisms［J］Muscle Nerve. 23(5):661-679,2000.
［5］ Robert J.Talmadge and Roland R.Roy. Electrophoretic separation of rat skeletal muscle myosin heavy-chain isoforms［J］.J Appl Physiol.1993,75(5):2337-2340.
［6］ A.X.Bigard, Sanchez,O.Birot, and B.Serrurier. Myosin heavy chain composition of skeletal muscles in young rats growing under hypobaric hypoxia conditions［J］. J Appl Physiol.2000,88(2): 479-486.
［7］ Akihiko Ishihara, Kazuo Itoh, Yasuharu Oishi, Minoru Itoh,Chiyoko Hirofuji, Hitomi Hayashi. Effects of hypobaric hypoxia on histochemical fibre-type composition and myosin heavy chain isoform component in the rat soleus muscle［J］.Pflüger Archiv-Eur J Physiol. 1995,429(5):601-606.
［8］ Merja Perhonen, Timo E.S.Takala, Vuokko Kovanen. Effects of prolonged exposure to and physical training in hypobaric conditions on skeletal muscle morphology and metabolic enzymes in rats［J］. Pflügers Arch-Eur J Physiol. 1996, 432(1):50-58.
［9］ Haydar A.Demirel, Scott K.Powers, Hisashi Naito, Michael Hughes, and Jeff S Coombes. Exercise-induced alterations in skeletal muscle myosin heavy chain phenotype:dose-response relationship［J］.J Appl Physiol.1999,86(3):1002-1008.
［10］ Takao Sugiura, Akio Morimoto, and Naotoshi Murakami. Effects of endurance training on myosin heavy-chain isoforms and enzyme activity in the rat diaphragm.［J］.Pflügers Arch. 1992,421(1):77-81.
［11］ Darryn S.Willoughby and Matthew J.Nelson. Myosin heavy-chain mRNA expression after a single session of heavy-resistance exercise［J］.Med Sci Sports Exerc. 2002,34(8):1262-1269.
［12］ 徐心浩.力量和耐力训练对肌球蛋白重链及肌纤维转型的影响［J］.北京体育大学学报，2004，27(11)：1492-1495.
［13］ 潘同斌，王瑞元，袁建琴，等.慢性低氧及跑台训练对大鼠骨骼肌肌球蛋白重链(MHC―亚型基因表达的影响［J］.北京体育大学学报，2005，28(1)：57-59.
［14］ 王瑞元，苑玉和，冯炜权.次力竭性离心运动后大鼠骨骼肌MHC各同功型基因表达及针刺对其影响［J］.北京体育大学学报，2002，25(2)：189-190.
关键词:心肌肌球蛋白;分离纯化;硫酸铵盐析
中图分类号:Q512.2 文献标识码:A
心肌肌球蛋白(cardiac myosin,CM)分子量约520KDa,由两条重链(MHC,220 KDa)和两对轻链(MLC1,27KDa;MLC2,20KDa)组成[1]。CM具有ATP酶活性,是心肌的主要结构和收缩蛋白。心肌收缩能力受多种因素的影响,兴奋收缩耦联的各个环节都能影响收缩力,其中肌球蛋白ATP酶活性是控制收缩能力的主要因素。
研究表明,CM结构或功能的改变与心室功能障碍、心力衰竭和心律失常等心肌病变有直接关系[2,3]。因此,从心肌组织中有效分离纯化CM,是在分子水平上,深入研究心肌病变的发病机理和预防措施的重要前提。目前提取纯化CM都是利用肌球蛋白在高离子强度下可溶,而在低离子强度下不溶的性质进行的,但大多操作繁琐,成本高,蛋白收率低或ATP酶活损失大[4-11],因此,寻找更佳的CM提纯方法具有重要意义。
本文对提纯方法进行了部分改进,从猪心肌提取了CM,建立了CM的纯化方案。此方案仅需简单的超速离心、硫酸铵分级盐析操作,即可达到纯化要求,且所用材料均为实验室常规用材,费用低廉,可广泛应用于实验室操作及临床研究。
1 实验部分
1.1 仪器、材料与试剂
1.1.1 主要仪器
CP100MX超速冷冻离心机(HITACHI, 日本),Centrifuge5417R 台式冷冻离心机(eppendorf, 德国),Ultra Freeze 5410超低温冰箱(HETO公司,捷克),CR22G高速冷冻离心机(HITACHI, 日本),DY-Ⅲ垂直平板电泳成套设备(北京六一仪器厂),GeneGenius & GeneGnome凝胶成像系统(SYNOPTICS LTD, 英国),MAXI-DRY LYO真空浓缩(冻干)系统(HETO公司,捷克),L-7000高效液相色谱仪(L-7455 DAD 检测器,L-7300柱温箱,L-7100四元梯度泵,D-7000 HPLC 系统工作站软件包。HITACHI,日本),C18柱(江苏汉帮科技有限公司),D8-Advance Powder X-射线粉末衍射仪(Bruker公司,德国),HH-4 恒温水浴锅(金坛市科兴仪器厂), FK-A 组织捣碎机(江苏金坛佳美仪器公司), pHS-25酸度计(上海伟业仪器厂),磁力加热搅拌器(江苏省金坛医疗仪器厂)。
1.1.2 材料与试剂
新鲜猪心(冰生理盐水洗净后-70℃冰箱保存);低分子量Marker蛋白(上海基康生物技术有限公司);牛血清白蛋白(BSA, 分子量68 000, 电泳纯, Sigma公司); Na2ATP(AR Sigma公司);β-巯基乙醇(AR Amresco 公司);SDS(AR Sigma公司);丙烯酰胺(AR 广州维佳科技公司, 日本分装);N', N'-甲叉二甲基双丙烯酰胺(AR 瑞士进口分装);硫酸铵(AR Sigma公司);N,N,N',N'-四甲基乙二胺(TEMED, AR 上海润洁有限公司, 生化试剂);考马斯亮蓝R-250、G-250(AR Amresco 公司);三羟甲基氨基甲烷(Tris, AR Sigma公司);其它试剂均为国产分析纯,实验用水为超纯水。
1.2 实验方法
1.2.1 CM的提取及纯化
4℃下操作。pH7.4的Tris-HCl缓冲液中均含有0.001 mol•L-1EDTA,0.01 mol•L-1NaPPi,0.002 mol•L-1β-巯基乙醇和0.005 mol•L-1MgCl2。
1.2.1.1 CM粗提液的制备
取猪心左心室适量,剪成小块后加入400 mL 0.05 mol•L-1磷酸缓冲液(pH=6.8)匀浆,3600 rpm离心10 min,反复4次,弃上清。沉淀溶于适量0.01 mol•L-1 Tris-HCl缓冲液(含0.5 mol•L-1KCl),离心,上清即为CM粗提液。
1.2.1.2 低盐析出,浓盐溶解
上清中加入9倍体积超纯水,调节溶液pH至5.4,缓慢搅拌3 h后10000 rpm离心10 min。用适量0.05 mol. L-1Tris-HCl(含1.0 mol•L-1 KCl)溶解沉淀,并用0.01 mol. L-1 Tris-HCl(含0.5 mol•L-1 KCl)透析过夜。
1.2.1.3 超速离心
于透析后的溶液中加入等体积超纯水及Na2ATP,使Na2ATP的浓度为0.002 mol.L-1。静置2 h后30000 rpm离心60 min,收集上清。
1.2.1.4 硫酸铵分级盐析
在上清液中加入研细的(NH4)2SO4达到36%饱和度,用(NH4)2SO4饱和度为36%的0.05 mol•L-1 Tris溶液调节pH在6.8~7.0之间,静置2 h后12000 rpm 离心。再向上清液加入(NH4)2SO4使饱和度达41%,用(NH4)2SO4饱和度为41%的0.05 mol•L-1 Tris溶液调节pH在6.8~7.0之间,静置2 h后离心。沉淀物用少量0.01 mol•L-1Tris-HCl(含0.6 mol•L-1KCl,不含MgCl2)重溶、透析24 h,更换透析外液4~5次。所得浓缩的CM溶液分装或冷冻干燥后,冷冻储存。
1.2.2 蛋白质含量测定
采用Bradford法[12],以BSA为基准物质,绘制标准曲线。
1.2.3 CM的ATP酶活力测定
参照文献[13]的方法,建立酶反应体系,置37℃水浴中孵育反应10 min。离心后取上清25 μL测定A660。根据磷标准曲线确定无机磷含量。规定肌球蛋白ATP酶活性单位(U)为单位时间(1 min)内单位质量(1.0 mg)的肌球蛋白催化ATP分解所释放的无机磷的微摩尔数,即1U=1 μmol•mg-1•min-1,此酶活单位即为单位比活力。
1.2.4 CM的纯度鉴定
将样品蛋白用0.01 mol•L-1 Tris-HCl缓冲液(pH7.5, 0.6 mol•L-1 KCl, 0.01 mol•L-1 NaPPi, 0.001 mol•L-1 EDTA, 0.002 mol•L-1β-巯基乙醇, 0.005 mol•L-1 MgCl2)稀释到1.0 mg•mL -1,取适量与2倍上样缓冲液等体积混合同Marker蛋白一起加热煮沸5 min。冷却至室温后离心(6000 rpm,5 min),取上清液上样10 μL,Marker蛋白上样20 μL。采用PAGE不连续垂直板不连续电泳法[14],浓缩胶浓度4%,分离胶浓度10%,凝胶厚度约0.75 mm,调节电压80 V开始电泳,当溴酚蓝指示剂迁移至浓缩胶和分离胶界面时将电压升至120 V,稳流电泳2 h。胶片用考马斯亮蓝R-250染色,置摇床经甲醇-冰乙酸-水(25867,V/V)溶液脱色至透明后于凝胶成像系统下观察结果并摄像。
1.2.5 HPLC条件
流速1.000 mL•min-1,TC = 30℃,样品浓度 1.6 mg•mL-1,进样量 10 μL,检测波长λ = 254 nm,C18柱(250×4.6 mm)。流动相A:6%乙腈,流动相B:0.20 mol•L-1磷酸钠缓冲液(pH 7.0),流动相A流动相B(V/V) = 60%40%。
1.2.6 X-射线粉末衍射条件
X-射线源Cu Kα 线,电压40 kV,电流40 mA,扫描角度20～120°(2θ),扫描速度1°•min-1。
2 结果与讨论
2.1 猪心肌CM的分离纯化
表1为猪心肌CM分离纯化过程中蛋白收率和酶活力变化情况。对CM粗提液和硫酸铵盐析纯化后的总蛋白、总活力、比活力进行测定,计算活力得率,纯化倍数,统计结果见表2。
在低盐析出、浓盐溶解过程中,本文对文献方法进行改进,在降低离子强度的同时,调节溶液pH至CM的等电点,使沉淀更加完全。由表1可知,肌球蛋白逐步被纯化,经硫酸铵分级盐析后,CM收率为4.5 mg•g-1湿组织。该结果是亲和层析纯化法的23倍[10],与Shiverick [8] 的结果相近,而文献方法溶液用量大,需多次超速离心,操作繁琐。
表2说明,CM粗提液的比活力为0.064U•mg-1,纯化后的比活力为0.293 U•mg-1,纯化倍数4.9, 活力得率42.1%。文献[15]采用DE 52层析法的纯化倍数为2.9,活力得率7.8%,效果不如本法。
2.2 CM纯度鉴定
CM提纯过程中的SDS-PAGE图谱(图1)说明,超速离心(图1(3))和分级盐析(图1(4)、(5))步骤去除了分子质量约43KDa的肌动蛋白(actin)和其它杂蛋白,但也有部分CM损失。纯化的CM(图1(5))显示了典型的肌球蛋白电泳带,最上面一条为重链,下面两条为两对轻链,与文献报道一致。重链下方的一些细小条带,可能是提纯过程中CM自身降解所致[16,17]。因此,在缓冲液中加入焦磷酸钠、EDTA、ATP、Mg2+等,并尽量缩短时间、低温操作,可起到降低CM聚合、保持其酶活性的作用[18]。
M-Marker蛋白; 1-粗提的肌球蛋白; 2-浓盐溶解所得蛋白;3-超速离心所得蛋白;4-弃去的36%饱和度(NH4)2SO4沉淀;5-终产物即41%饱和度(NH4)2SO4沉淀
2.3 HPLC分析
图2显示了相同条件下,CM的粗提液和纯化后的HPLC图。
色谱条件:流速1.000 mL•min-1,TC = 30℃,λ = 254 nm,进样量 10 μL(1.6 mg•mL-1),C18柱(250×4.6 mm),流动相A:6%乙腈,流动相B:0.20 mol•L-1磷酸钠缓冲液(pH7.0),流动相A流动相B(V/V)= 60%40%
由图2可知,保留时间2.21 min的组分为纯化的CM,通过超速离心和硫酸铵盐析等步骤,除去了保留时间2.05 min的主要杂蛋白。
2.4 X-射线衍射(XRD)图谱
图3为CM的XRD图谱。图中显示了确定的锐衍射峰,其中2θ 在28.4°和40.6°出现两个强的衍射峰,在45~80°出现三个较弱的衍射峰,说明CM具有一定结晶性的特征[19]。
3 结论
对传统方法稍加改进,从猪心肌中提取CM,并用36-41%饱和度硫酸铵进行纯化。利用SDS-PAGE、HPLC和XRD对CM的纯化程度进行了表达和分析。提纯后CM的 HPLC图显示单一峰,电泳谱带与文献报道一致,说明硫酸铵盐析有效除去了肌动蛋白和其它杂蛋白,纯化的CM基本达电泳纯。CM的XRD图谱有两个强的衍射峰,说明其有结晶性特征。提纯的蛋白得率为4.5 mg•g-1湿组织,比活力0.293 U•mg-1,纯化倍数4.9,活力得率42.1%。与文献相比,本法操作简单、成本低廉,得率高并保持了较高的酶活性,具有较高的实用价值。
参考文献
[1]Lowey S, Risby D. Light chains from fast and slow muscle myosins. Nature, 1971, 234.
[2]Kessler -lecklon G. Effect of triiodothyronine on cultured neonatal rat heart cells: beating rate, myosin subunits and CK-isozymes. J Mol Cell Cardiol, 1988, 20.
[3]Shalitin N, Friedman M, Schlesinger H, Barhum Y, Levy MJ, Schaper W, Kessler-Icekson G.The effect of angiotensin Ⅱ on myosin heavy chain expression in culturedmyocardial cells. In Vitro Cell Dev Biol-An, 1996,32.
[4]Lawrence Long, Ferenc Fabian, Dean T. Masin, et al.A new cardiac myosin characterized from the canine atria. Biochem Biophys Res Commun, 1977, 76(3).
[5]Umeji Murakami, Koki Uchida, Toshiaki Hiratsuka. Carciac myosin from pig ventricle: purification and enzymatic properties. J Biochem, 1976, 80(3).
[6]邹立华, 陈灏珠, 杨一峰等. 心肌肌球蛋白及其重链的提纯与鉴定[J]. 上海医科大学学报, 1996 (2).[7]朱彬, 万朝敏, 肖静等. 心肌肌球蛋白的提取及其酶活性的研究[J]. 药物生物技术, 2002 (2).
[8]Shiverick KT, Thomas LL, Alpert NR. Alpert Purification of cardiac myosin Application to hypertrophied myocardium. BBA-Protein Struct, 1975, 393(1).
[9]刘继林, 王杰, 赵文君 等. 猪心肌球蛋白及其轻、重链亚基的纯化和鉴定[J]. 徐州医学院学报, 1996, 16(3).
[10]Strohsacker MW, Minnich MD, Clark MA, et al. Selective purification of cardiac myosin by a high-performance salicylate affinity column. J Chromatogr A, 1988, 435.
[11]Wikman-Coffelt J, Zelis R, Fenner C, Mason DT. Myosin chains of myscardial tissue-Ⅰ Purification and immunological properties of myosin heavy chains. Biochem Biophysl Res Commun, 1973, 51(4).
[12]Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.Biochem, 1976, 72.
[13]Chan KM, Delfert D, Junger KD. A direct colorimetric assay for Ca2+-stimulated ATPase activity.Biochem, 1986, 157(2).
[14]何忠效, 张树政. 电泳[M]. 北京: 科学出版社, 1999.
[15]鲁云霞, 周青, 汪惠园等. 兔骨骼肌肌球蛋白轻链的分离纯化[J]. 安徽医科大学学报, 2000 (1).
[16]Xu J, Root DD. Domain Motion between the Regulatory Light Chain and the Nucleotide Site in Skeletal Myosin. J Struct Biol. 1998, 123(2).
[17]Trybus KM. Biochemical Studies of Myosin. Methods, 2000, 22(4).
[18]朱彬, 万朝敏, 刘荣韬等.Ca2+、Mg2+对心肌肌球蛋白ATP酶活性的影响[J]. 航天医学与医学工程, 2002 (5).
[关键词] 共同性斜视 眼外肌组织化学染色免疫组化染色
共同性斜视其发病机制比较复杂，可能与辐凑和分开兴奋不平衡有关，还可能与解剖因素、遗传因素等有相当的联系。视动功能需要快速而有力的肌肉收缩来完成，视静功能需要肌肉长久维持一种姿势张力。本研究分别采用免疫组织化学染色的方法对共同性斜视患者弱侧眼外肌和正常人眼外肌的收缩蛋白和快慢纤维进行研究，现将结果报告如下。
1 材料和方法
1.1 材料：收集福建医科大学附属第一医院眼科中心2006年1月至2006年11月共12例共同性斜视患者弱侧眼外肌作为实验组，其中内斜视7例，外斜视5例；男性6例，女性6例；年龄最小7岁，最大25岁，平均14岁；于斜视矫正手术中取其缩短的直肌为标本。收集同期无眼肌疾患行眼球摘除的患者6例作为对照组，于手术中取其直肌为标本。所有标本在离体后用显微手术剪剪成2部分，均为4×4×2mm大小，一份立即置于10%甲醛中性固定液中，石蜡包埋，待用；一份速存于液氮速冻后-80℃保存，待用。
1.2 主要试剂：三磷酸腺苷二钠盐（ATP 产地美国，购自上海捷瑞生物工程有限公司）；鼠抗人肌动蛋白单克隆抗体（购自北京中杉公司）；鼠抗人骨骼肌肌球蛋白单克隆抗体（购自北京中杉公司）； PV9000二步法检测系统（美国GBI公司产品，购自北京中杉公司）
1.3 肌球蛋白及肌动蛋白免疫组织化学步骤：取包埋好的肌组织沿肌肉长轴及纵轴连续切片2张，层厚约为5 μm，脱蜡和水化；3%H2O2去离子水孵育10分钟， PBS液冲洗；滴加一抗 ，37℃孵育一个小时，PBS液 冲洗； 滴加 Polymer Helper， 37℃孵育20min，PBS液冲洗；滴加二抗，37℃孵育20分钟，PBS液冲洗；DAB显色；自来水冲洗，苏木素轻度复染，自来水冲洗返蓝；梯度酒精脱水干燥、二甲苯透明、中性树胶封片。
1.4 观察方法：光镜下观察免疫组化染色结果。肌动蛋白和肌球蛋白阳性反应为棕黄色颗粒，主要表达于细胞浆，在放大200倍下对热点视野以OLYMPUS BH2显微摄像系统对切片进行摄像，每张切片取5个视野，每个视野取100个肌纤维作形态学图像分析（JEDR 801D形态学图像分析系统6.0软件，福建医科大学组胚教研室提供），取平均光密度值，数据以“均数标准差”表示。
1.5 数据统计分析方法：运用SPSS 11.5软件包对数据进行处理。组间差异采用成组t检验方法，检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 肌动蛋白的表达 光镜下棕黄色颗粒为肌动蛋白阳性染色，表达在肌浆中 (图1，图2为免疫组织化学两步法，DAB染色, 苏木素复染，×200）。
对照组切片可见明显的棕黄色颗粒；共同性斜视组切片可见棕黄色颗粒表达明显减弱，表明对照组较共同性斜视组肌动蛋白表达明显，平均光密度值较高。两组平均光密度值结果以 表示，组间差异采用成组t检验。结果显示两组间的差异有统计学意义（表1）。
2.2 肌球蛋白的表达 光镜下棕黄色颗粒为肌球蛋白阳性染色，表达在肌浆中 (图3，4为免疫组织化学两步法，DAB染色，苏木素复染，×200)。
对照组可见明显的棕黄色颗粒；共同性斜视组中可见棕黄色颗粒表达明显减弱，表明对照组较共同性斜视组肌球蛋白表达明显，平均光密度值较高。两组光密度结果以 表示，组间差异采用成组t检验。结果显示两组间的差异有统计学意义（表2）。
3 讨论
眼位偏斜不能被融合机能所遏制，眼球运动无障碍，各种方向注视时斜视角保持恒定者，称为共同性斜视。共同性斜视的病因学说不一[2]，主要有：1．调节学说；2．双眼反射学说；3．解剖学说；4．遗传学说。各种学说均有一定的理论根据，但尚无一种学说能够解释所有的共同性斜视的问题。
骨骼肌负责运动功能的蛋白质主要是收缩蛋白质，即肌球蛋白和肌动蛋白，它们存在于肌原纤维中。肌球蛋白是粗肌丝的主要成分，具有二个生物学作用：一是具有ATP酶活性，能裂解ATP，释放化学能；二是具有与肌动蛋白结合的能力。它决定了肌纤维收缩的速度和力量，是肌纤维收缩特性的最主要决定因素。肌动蛋白结构及功能相对简单，分子单体上有与肌球蛋白头相结合的位点 [1]。关于肌球蛋白和肌动蛋白异常性疾病国内外报道较多的是选择性肌球蛋白缺失性肌病，这种肌病临床表现为不同程度的肌肉无力和麻痹，是肌肉组织去神经化所致的肌肉源性肌病[3]， 其主要的病理改变：光镜下肌球蛋白三磷腺苷酶阳性物质减少或消失[3]；电镜检查可看到大范围选择性的肌球蛋白粗肌丝丧失,较少累及肌动蛋白丝和肌纤维Z区[4]。
本研究对肌纤维肌动蛋白和肌球蛋白的免疫组织化学染色，通过鼠抗人肌动蛋白单克隆抗体和鼠抗人骨骼肌肌球蛋白单克隆抗体对两组标本进行研究。结果发现共同性斜视组肌动蛋白和肌球蛋白的表达与对照组相比明显下降（光密度值两组间比较有显著性差异，P值＜0.01）。根据这一发现，我们认为眼外肌收缩蛋白表达下降在共同性斜视的形成过程中可能起重要作用，并且这一发现在某种程度上也支持了共同性斜视发病机制中的肌肉源性因素。
本研究应用免疫组织化学二步法，检测了正常人和共同性斜视病人弱侧眼外肌的肌纤维分型分布和两种收缩蛋白包括肌球蛋白和肌动蛋白的表达情况，初步阐明肌纤维分布和收缩蛋白表达情况在共同性斜视的发病中可能起重要作用，并从两个方面证明了共同性斜视发病机制中的肌源性因素，为共同性斜视发病机制的进一步研究打下基础，而关于亚型肌纤维的存在与否有待进一步研究。
参考文献
[1] Pelouch V. Molecular aspects of regulation of cardiac contracti on. Physiol Res,1995,44(1):53
[2] Massa R, Carpenter S, Holland P, et al: Loss and renewal of thick myofilaments in glucocorticoid-treated rat soleus after denervation and reinnervation. Muscle Nerve 1992; 15:1290-1298
[4] Hughes M, Grant IS , Biccard B ,et al. Suxamethonium and critical illness poly neuropathy. Anaesth Intensive Care ,1999 ,27 :636 - 638.
关键词：肌球蛋白；L-精氨酸；保水性；硬度；微观结构；热特性
保水性和质构是肉制品的重要品质特性，对肉制品的产率与口感有十分重要的影响[1]。钠盐的使用是目前提高肉制品保水性和质构的重要手段之一。在肉制品加工过程中，氯化钠能够改善产品的风味、嫩度和性等品质特性，有利于产品的保藏[2]。但是，摄入过量钠盐可诱发高血压[3]，增加中风及心脑血管的发病几率[4]；降低肉制品钠盐的使用量，将降低产品风味、口感，缩短产品货架期。因此，研发钠盐替代物显得尤为重要。
研究表明，添加精氨酸可提高猪肉肠的保水性、硬度、咀嚼性、弹性以及其他感官性能，提高猪肉糜蛋白的变性温度，有利于光滑、致密、均匀凝胶的形成[5]，在肉制品加工中具有潜在的应用前景。
盐溶蛋白是肌肉中的重要蛋白成分，参与肉凝胶的形成过程，对肉制品的保水性和质构特性产生重要影响[6]。研究精氨酸对盐溶蛋白凝胶形成的影响有利于揭示精氨酸对肉制品保水性和质构特性的影响机制。然而，迄今为止，国内外关于外源性氨基酸对盐溶蛋白热凝胶的影响研究很少[7]；精氨酸对肌球蛋白热诱导凝胶的影响尚未见报导。本研究以鸡胸肉中提取的肌球蛋白为研究对象，考察不同添加量（0～0.09%）L-精氨酸对肌球蛋白凝胶的硬度、保水和微结构等凝胶特性以及肌球蛋白溶液热特性的影响，以探讨L-精氨酸对肉制品保水性和质构特性影响的机制，为低钠肉制品研发提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
鸡胸肉购于合肥市家乐福超市。
磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、二硫苏糖醇（dithiothreitol，DTT）、焦磷酸钠、乙二胺四乙酸二钠、氯化钾、无水乙醇、丙酮、戊二醛、甲醛等均为分析纯。
1.2 仪器与设备
BC/BD-241冰柜 青岛Haier集团公司；ML104型电子分析天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；SCX-8/2A绞肉机 上海双碟厨具有限公司；DS-1组织捣碎机 上海越磁电子科技有限公司；GL-21M高速冷冻离心机 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；CT14RD冷冻离心机 上海天美生化仪器设备有限公司；8S-1磁力搅拌器 江苏省金坛市金城国胜实验仪器厂；752N紫外-可见分光光度计 上海精密科学仪器有限公司；FD-1A-50冷冻干燥机 北京博医康实验仪器有限公司；TA-XT Plus硬度仪 英国Stable Micro System公司；JSM6490LV扫描电子显微镜 日本JEOL公司。
1.3 方法
1.3.1 肌球蛋白的提取
肌球蛋白提取：参照Chen等[8]的方法，将鸡胸肉剔除可见脂肪和结缔组织，切碎后取约150 g，在0～4 ℃条件下提取肌球蛋白。肌球蛋白溶液浓度的测定参照Zhou等[9]的方法，利用0.6 mol/L氯化钾磷酸盐缓冲溶液（pH 6.5），将蛋白质质量浓度调整至20 mg/mL，待用。
1.3.2 肌球蛋白-精氨酸混合溶液的制备
参照史可夫等[10]的方法，分别向50 g 20 mg/mL肌球蛋白溶液中加入L-精氨酸，使L-精氨酸质量分数分别达到0.00%、0.01%、0.03%、0.05%、0.07%、0.09%。在0～4 ℃条件下缓慢搅拌30 min，至完全溶解，在冰箱中（约4 ℃）静置过夜（约12 h），形成肌球蛋白-精氨酸混合溶液待用。
1.3.3 肌球蛋白-精氨酸混合凝胶的制备
参照史可夫等[10]的方法，将处理后的肌球蛋白-精氨酸混合凝胶样品倒入小烧杯（27 mm×35 mm），放在20 ℃水浴锅中，以2 ℃/min的升温速率加热至80 ℃，并恒温处理30 min，取出小烧杯放入冰水浴中冷却10 min，放入冰箱中过夜（约12 h），待测。
1.3.4 凝胶保水性的测定
参照Qin等[11]的方法。取约10 g肌球蛋白-精氨酸凝胶在1 000 g/min下离心10 min，重复检测3 组。
1.3.5 凝胶硬度的测定
参照Zhou等[9]的方法。采用TA-XT Plus质构仪，设定GMIA程序测定肌球蛋白-精氨酸混合凝胶的硬度。参数设定：探头选用P/0.5，测试前速率1.50 mm/s，测试中速率1.00 mm/s，测试后速率1.00 mm/s，穿刺距离4 mm，触发力5 g。检测重复3 次。
1.3.6 扫描电子显微镜的测试
参照Qin等[11]的方法。将肌球蛋白-精氨酸凝胶样品放置在4%甲醛和2.5%戊二醛混合溶液（1∶1，V/V）中浸泡固定2 h，在凝胶样品固定变硬后，将样品均匀地切成10 mm×10 mm×2 mm的薄片；采用0.1 mol/L磷酸盐缓冲溶液（pH 7.2）漂洗5～10 次；用不同体积分数的乙醇（30%、40%、60%、80%和100%）溶液脱水，每次浸泡10 min，在通风厨中用冷风除去易挥发的有机溶剂；在真空冷冻干燥机中干燥15 h；喷金，观察。
1.3.7 肌球蛋白热特性的检测
参照陈星[12]的方法并稍加改动。称取10～15 mg蛋白样品，密封于铝坩埚中，放入设备中，并同时以空的铝坩埚作为对照。起始温度为20 ℃，并在此温度下平衡5 min，再以2 ℃/min升至80 ℃，收集其热相变温度T及相变焓值H。实验重复3 次。
1.4 数据处理
结果以平均值±标准差的形式表示，采用Excel 2007进行数据处理，以Origin 8.0进行绘图，方差分析中的显著性检验采用IBM SPSS 19.0软件进行分析，当P
2 结果与分析
2.1 不同添加量L-精氨酸对肌球蛋白凝胶保水性的影响
样品1～6. L-精氨酸添加量分别为0.00%、0.01%、0.03%、0.05%、0.07%和0.09%。下同。
由图1可知，与空白组相比，添加精氨酸
（L型，下同）能够很明显地提高肌球蛋白凝胶的保水性
（P0.05），这可能是由于精氨酸添加量的变化不足以明显改变蛋白溶液的pH值，或添加精氨酸所导致的pH值的改变不足以显著提高其保水性。虽然差别不显著，但是仍然可以发现，随着精氨酸的增加，肌球蛋白凝胶的保水性呈逐渐升高的趋势，意味着精氨酸的添加有利于改善肉制品的产率及性。
2.2 不同添加量L-精氨酸对肌球蛋白凝胶硬度的影响
由图2可知，相对于空白组，添加了精氨酸的肌球蛋白混合凝胶的硬度显著降低（P
2.3 不同添加量L-精氨酸对肌球蛋白凝胶微观结构的影响
A～F. L-精氨酸添加量分别为0.00%、0.01%、0.03%、0.05%、0.07%和0.09%。
由图3可知，空白组的肌球蛋白凝胶由大小不均一的无规则的空洞和不规则的团状聚集物共同组成。
Qin[11]、Sun[23]等研究表明，未添加精氨酸的肌盐溶蛋白加热也形成相对粗糙的凝胶。当精氨酸的加入量达到0.03%和0.05%时，可以明显观察到肌球蛋白凝胶较为平整，且团状聚集物呈现减少的现象。随着添加量增加到0.07%和0.09%时，可以看到肌球蛋白凝胶三维网状结构中分布着较为均匀的孔洞。Sun等[23]认为，蛋白凝胶的保水性与其孔径呈负相关，添加精氨酸导致凝胶结构的变化可能与其保水性的变化密切相关。另外，多孔的凝胶结构与其硬度降低也可能有关。
2.4 不同添加量精氨酸对肌球蛋白凝胶热特性的影响
由图4及表1可知，空白组的差示扫描量热（differential scanning calorimetry，DSC）呈现出2 个特征峰，分别位于52.81 ℃和66.95 ℃，这与Ma等[16]的研究结果基本一致。有研究[23-24]报道，位于52.81 ℃特征峰为肌球蛋白头部变性所致，而位于66.95 ℃特征峰为肌球蛋白尾部变性所致。相较于空白组，精氨酸的添加量达到0.03%以上时，第1个峰对应的温度显著降低
（P
[15] Guo X Y， Peng Z Q， Zhang Y W， et al. The solubility and conformational characteristics of porcine myosin as affected by the presence of L-lysine and L-histidine[J]. Food Chemistry， 2015， 170： 212-217. DOI： 10.1016/j.foodchem.2014.08.045.
[16] Ma F， Chen C G， Zheng L， et al. Effect of high pressure processing on the gel properties of salt-soluble meat protein containing CaCl2 and κ-carrageenan[J]. Meat Science， 2013， 95（1）： 22-26.
[17] Cao Y Y， Xia T L， Zhou G H， et al. The mechanism of high pressure-induced gels of rabbit myosin[J]. Innovative Food Science and Emerging Technologies， 2012， 16： 41-46. DOI：10.1016/j.ifset.2012.04.005.
[18] Galazaka V B， Smith D， Ledward D A， et al. Complexes of bocine serum albumin with sulphated polysaccharides： effects of pH， ionic strength and high pressure treatment[J]. Food Chemistry， 1999， 64（3）： 303-310.
[19] 费英， 韩敏义， 杨凌寒， 等. pH对肌原纤维蛋白二级结构及其热诱导凝胶特性的影响[J]. 中国农业科学， 2010， 43（1）： 164-170. DOI：10.3864/j.issn.0578-1752.2010.01.019.
[20] Reddy KRC， Lilie H， Rudolph R， et al. L-Arginine increases the solubility of unfolded species of hen egg white lysozyme[J]. Protein Science， 2005， 14（4）： 929-935. DOI：10.1110/ps.041085005.
[21] 周光宏. 畜产品加工学[M]. 北京： 中国农业出版社， 2011.
[22] Samejima K， Ishioroshi M， Yasui T. Relative roles of the head and tail portions of the molecule in heat-induced gelation of myosin[J]. Journal of Food Science， 1981， 46（5）： 1412-1418.
[23] Sun J X， Wu Z， Xu X L， et al. Effect of peanut protein isolate on functional properties of chicken salt-soluble proteins from breast and thigh muscles during heat-induced gelation[J]. Meat Science， 2012， 91（1）： 88-92. DOI：10.1016/j.meatsci.2011.12.010.
关键词：肌球蛋白重链；生肌调节因子；耐力训练
中图分类号：G804.7
文献标识码：A
肌球蛋白是骨骼肌细胞中表达最多的蛋白，占总蛋白的25%。天然的肌球蛋白由6条多肽链组成，这6条多肽链包括两条重链和两对不同的轻链。肌球蛋白重链(Myosin heavychain，MHC)分子质量约为200 000 u两对不同的轻链分别为碱性轻链和调节轻链。肌球蛋白因其具有ATP酶活性，所以又称肌球蛋白Ca2+-ATP酶。
快肌和慢肌的最大缩短速度与肌球蛋白高低的Ca2+-ATP酶活性相关[1]。这主要由于快慢肌所表达的MHC类型不同。快型肌纤维含有快型MHC异型体，表达为高的肌球蛋白Ca2+-ATP酶活性，同样，慢型肌纤维含有慢型MHC异型体，表达为低的肌球蛋白Ca2+-ATP酶活性。研究肌肉肌球蛋白重链组成对于了解肌肉收缩特性有重要意义。
研究表明，肌肉MHC组成是可以发生改变的，这些因素包括胚胎发育、神经交叉支配、激素、运动、非活动性因素等等。但调控MHC表达的机制一直不很清楚。
最近有报道显示，生肌调节因子(Myogenic regulatoryfactors，MRFs)参与胚胎期肌发生过程，并在成年骨骼肌中选择性表达。因此，研究MRFs对于了解MHC转变机制具有积极的意义。
生肌调节因子属于碱性螺旋一环一螺旋(bHLH)转录调节因子，可以结合DNA，调节基因的转录，由MyoD、myogenin、myf5、MRG4个蛋白组成。MRFs可与E盒(E蛋白)形成异二聚体，这个异二聚体反过来结合到E盒特异的DNA序列上，转录调节DNA的表达。这个E盒序列已被检测为CANNTG(N为任意碱基)，在几个肌肉表型蛋白的调控区，如快肌球蛋白的轻链、MHC Ⅰ和MHCⅡh[2]、肌钙蛋白Ⅰ和desmin上都有E盒的存在。
1材料与方法
1．1 实验动物
雄性SD鼠20只，体重(232±10)g，由河北医科大学实验动物中心提供。动物随机分成两组，安静对照组10只(C)、耐力训练组10只(T)，均分笼饲养，自由饮水进食，室内温度(22±3)℃。
1．2运动方式
耐力训练组首先熟悉跑台，每天进行递增的跑台练习(跑速10～20m／min，持续时间10～60min／d)，5d后正式开始训练。跑台坡度10°，跑速22 m／min，持续时间60 min／d，运动强度约70％～75％VO2max。跑台训练共计28 d。
1．3主要试剂和仪器
(1)骨骼肌肌球蛋白重链(MHC)蛋白组成：(SDS―PAGE方法，参照Talmadge[3]) 仪器：LKB 2301 Macrodrive 1,Power Supply；LKB 2050Midget Electrophoresis Unit．
试剂：SDS为BIOMOL公司产品，优级纯；Tris为AUGUS公司产品，超级纯；TEMED、β巯基乙醇为SERVA公司产品，研究级。
(2)骨骼肌MHC Ⅰ、Ⅱa、Ⅱx／d、Ⅱb4个亚型及MyoD、myogenin的mRNA基因表达：(RT-PCR方法)
试剂：逆转录酶(M-MLV)、Oligo(dt)、dNTP为Promega公司产品，Taq酶为Takara公司产品，PCR引物由北京奥科生物技术有限责任公司设计、合成。
1．4实验步骤
(1)肌肉组织提取：训练28 d的鼠用戊巴比妥钠实施麻醉(50 mg/kg)，剥离出白色胫前肌浅层(TA)迅速投于液氮中保存待用。
(2)肌球蛋白提取：1)快速称取浅层胫前肌100 mg，置于1．9 mL匀浆液中(匀浆液成分：300 mmol／L KCl、150 mmoL／L K2HPO4、10 mmol／L ATP、2 mmol／L EDTA、2 mmol／LDTF．pH 6．8)。2)手动匀浆，制备好的匀浆轻轻振荡30 min。3)以20 000 dmin低温离心20 min。4)取上清加入饱和(NH4)2SO4至33％饱和度，静置20 min。5)再以12 000 r／min离心15 min，获得沉淀即为肌球蛋白。6)收集沉淀于l mL咪唑缓冲液中(600 mmol／L KCI,10 mmol／L咪唑pH 6．8)，1000 mL 10 mmol／L咪唑(pH 6．8)透析24 h。所有操作均在4℃条件下进行。
SDS-PAGE检验肌球蛋白提取情况。
(3)骨骼肌肌球蛋白重链(MHC)蛋白组成：(SDS-PAGE法，参照Talmadge1993)。
(4)骨骼肌MHC Ⅰ、Ⅱa、Ⅱx、Ⅱh 4个亚型及MyoD、myagenin的mRNA基因表达。
总RNA提取参照Trizol说明书。引物设计见表1。
1．5统计分析
采用SPSS11．5统计软件，利用多因素方差一般线性模型(GLM)LSD方法检验各组间的差异，P
2结果与讨论
2．1 运动对浅层胫前肌肌球蛋白重链蛋白组成的影响
由表2所见，SDS-PAGE方法结果显示耐力练习组(T)与对照组(C)比较，Ⅰ、Ⅱa、Ⅱx和ⅡbMHC蛋白表达的百分比没有明显差异，即耐力训练不改变MHC的蛋白组成百分比。
耐力训练是一种增加负荷的训练，学者们通常认为耐力训练会引起快型MHC向慢型转化。如有观察大鼠轮跑4周比目鱼肌I型MHC显著增加。Demirel等[4]对于SD大鼠75％强度跑台训练10周的实验注意到训练时间>160 mi。时比目鱼肌MHCI显著增加，同时MHCⅡa下降。Wi。tar鼠耐力练习(20m／min，60min／d)的研究显示，4周的耐力练
习足底肌MHCⅡh下降的同时MHCⅡa明显增加[5]。
也有研究显示，耐力训练不改变肌纤维和MHC组成。Perhonen等[6]。Wistar跑台训练，肌原纤维ATPase方法测得的趾长伸肌和比目鱼肌肌纤维组成无明显改变。Wistar，鼠的游泳训练不影响比目鱼肌肌纤维类型分布。Demirel等的实验中，当训练时间为每天30rain和60min时，没有观察到足底肌MHC蛋白组成的改变，但训练时间延长至90 mi。时观察到MHC组成的改变。Gollnick等[7]提出耐力训练后，人骨骼肌氧化潜能增加，但肌原纤维ATPase染色显示的快慢肌纤维比例没有改变。
本实验观察到跑台的耐力训练没有影响SD大鼠胫前肌MHC蛋白组成。
耐力训练对MHC的影响可能既取决于特异的肌肉又依赖于训练的量。不同肌肉肌纤维组成不同，运动中募集顺序不同[8]。随着训练时间的延长，会有越来越多的快运动单位被募集来补偿肌肉收缩的疲劳。短时间的次最大强度跑练习中，比目鱼肌较足底肌和趾长伸肌血流量更多也能说明运动过程中慢肌首先被动员，因而耐力训练对快慢肌的影响会存在差异。
肌球蛋白转换需最小的训练持续时间，这一观点已被Salmons[9]详细阐述过，这一理论简单说是活动水平必须超过肌球蛋白异型体发生的变化。我们的耐力训练的实验没有观察到MHC的改变，这可能与训练强度和持续时间都有关，如果适当提高跑台速度、延长训练时间也许会观察到MHC快型向慢型的转化。
2．2运动对骨骼肌MHC Ⅰ、Ⅱ a、Ⅱ x、Ⅱb4个亚型mRNA
表达的影响
RT-PCR图象如图1所示：
表3可知，RT-PCR方法显示耐力训练使MHC一ⅡxmRNA表达减少(P
关于耐力训练影响MHC组成的研究多集中于SDS-PAGE测得的蛋白水平的报道，或者肌原纤维ATP酶疗法检验肌纤维组成的改变。本文RT-PCR方法测定的各种MHC mRNA是在转录水平观察MHC的变化，转录是蛋白合成的前提，转录水平的变化为蛋白水平的改变提供可能性。本实验RT-PCR结果显示，耐力训练使MHC一ⅡxmRNA表达显著下降，MHC一Ⅱa mRNA表达不显著增加。MHCmRNA的这种变化趋势与以往对MHC蛋白组成的报道一致[1]。但本研究中MHC蛋白水平和mRNA水平的改变不一致。原因可能在于mRNA的增加能在刺激的即刻发生，其半衰期约为2-3 d，而相应蛋白的半衰期为2―3周[11]，MHC表型的表达可能是MHC mRNA与蛋白不同时机上调和下调的结果。因而MHC表型表达与MHC mRNA间会出现错配的现象。除此之外，翻译或翻译后机制的调控也妨碍mRNA准确地表达蛋白活性。
2．3运动对骨骼肌MyoD和myogenin mRNA表达的影响
本研究结果显示耐力训练使myogenin和MyoD mRNA表达均显著下降(P＜O．01)；myogenin／MyoD由于样本量少，且个体差异大，两组间没有显示出统计学上的显著差异(见表4)。
特异表型蛋白在不同收缩活动水平的协调表达，存在着共同的调节机制。一些研究证实，生肌调节因子(MRFs)在其中起重要作用。MRFS参与原始肌细胞的分化，在成年骨骼肌纤维的表达中也起重要作用。特别是MyoD与Mvogenin的相对表达是肌肉表型表达的决定因素。快肌纤维中MyoD表达相对较高，慢肌纤维中水平较低；Myogenin情况正好相反。MyoD与Myogenin的相对表达也表现在收缩引起肌肉表型改变的调节上。
体外刺激培养的肌管细胞，Myogenin表达增加的同时伴有MvoD表达下降，同时与快型肌肉相关的蛋白如肌浆网Ca2+-ATPase蛋白快型异型体、肌球蛋白重链Ⅱ表达受抑制[2]。
28d后肢悬垂后，与对照鼠的比目鱼肌相比，后肢悬垂鼠MHC-Ⅱa明显下降，MHC-Ⅱx增加，高敏感的RT-PCR方法测得后肢悬垂14 d后MyoD增加[13]。后肢悬垂引起慢肌向快肌转化的同时Myogenin表达不受影响。因此，作者认为MynD mRNA或Myogenin mRNA／MyoD mRNA可能在失重引起的肌肉萎缩及肌纤维的转换中起重要作用。
以上这些似乎暗示着MyoD、Myogenin mRNA或Myogenin／MyoD与肌肉表型间存在着因果关系。
本实验耐力训练条件下，Myogenin和MyoD mRNA均显著下降，同时，观察到MHC一Ⅱx mRNA显著下降(P
关键词 鳜鱼；肌球蛋白重链；原核表达；多克隆抗体
中图分类号 Q785 文献标识码 A 文章编号 10002537（2012）06006707
肌球蛋白是肌肉主要构成蛋白质之一．它由Kuhne于1859年首先报道，之后于1864年在研究骨骼肌收缩时发现并命名［1］．肌球蛋白不仅是基础蛋白收缩系统主要成分，也是一种复杂多聚体蛋白，在真核生物肌肉收缩过程中起到很关键作用［23］．在不同的动物种类之间，乃至鱼类不同品种间，肌球蛋白结构和表达存在着种属间差异性．大部分研究工作主要针对脊椎动物骨骼肌肉（主要是兔和鸡）、心脏肌肉、数种平滑肌而进行，同时也包括部分非肌肉系统肌球蛋白的研究．在鱼类中研究较多的是平滑肌组成的心肌肌球蛋白和横纹肌组成的肌肉肌球蛋白［4］．肌球蛋白不同类型的重链基因全序列克隆测序在多种脊椎动物中已经完成，其中包括大鼠（Rattas norvergicus）［5］、鸡［6］、人 ［7］以及鱼类中的斑马鱼［8］、大头鱼、虹鳟［9］、鲤鱼［10］，大黄鱼［11］和鳜鱼［12］等．因此，对鱼类肌球蛋白分子研究已扩展到不同鱼类品种肌球蛋白重链、轻链的基因克隆分析及其表达．Lied和Decken采用生物化学方法分离提取出虹鳟肌球蛋白重链，并采用此蛋白作为抗原制备出多克隆抗体，鉴定出其结合蛋白［11］．Crockford等［13］和Goldspink等［14］采用哺乳动物cDNA序列为引物从鲤鱼基因文库中克隆出其肌球蛋白重链基因，且证实此类基因表达受环境因子所控制；Kato和Konno测定出鲤鱼重链氨基末端和羟基末端分子结构和调节区域［15］．有关鱼类肌肉特异性基因肌球蛋白轻链（myosin light chains，MLC）、肌球蛋白重链（myosin heavy chains，MyHC）的cDNA序列分析所获取的数据，为蛋白质和基因结构进化分析提供基础．这些克隆和分离的基因已经用于研制核酸杂交探针，来研究肌球蛋白基因家族转录产物特异性组织表达、进化，以及染色体定位或突变等．
湖南师范大学自然科学学报 第35卷第6期
刘希良等：鳜鱼肌球蛋白重链基因的原核表达及多克隆抗体的制备本研究旨在通过将鳜鱼肌球蛋白重链基因片段亚克隆到pET32a质粒，构建出重组表达载体，大量诱导表达此蛋白，制备鳜鱼肌球蛋白重链多克隆抗体，为日后分析鳜鱼肌球蛋白重链基因表达对其肉质性状的影响，进而提高鱼类肉质品质提供理论基础和技术支持．
1 材料与方法
1.1 实验材料与主要试剂
体重1 kg 左右的鲜活鳜鱼购买于长沙水产市场，剪腮放血后取背部白色肌肉，-80 ℃冰箱保存备用．大肠杆菌菌种BL21（DE3）和DH5α均购于北京天根公司．原核表达载体pET32a为本实验室保存．限制性内切酶EcoRⅠ和HindⅢ购于TAKARA公司；Trizol试剂购于Invitrogen公司；100 bp Marker、MarkerⅢ、PCR扩增所需的试剂以及一抗AntiHis Antiboby 和二抗羊抗鼠购于北京天根公司；T4 DNA连接酶、低相对分子质量标准预染及非预染蛋白质Marker购于Fermentas公司；DNA胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒购于Promega公司；His融合蛋白纯化预装柱购于上海悦克生物科技有限公司．羊抗兔辣根过氧化物酶标二抗、DBA显色试剂盒购于武汉博士德生物公司．其余化学试剂均为国产分析纯．
1.2 试验方法
1.2.1 引物设计 根据作者已克隆得到的鳜鱼MyHC全长序列（GenBank：HQ829291）及原核表达载体pET32a的载体图谱，利用Primer Premer5.0软件设计一对引物，其序列分别为：
上游引物P+ 5′CAGAATTCATGGAAGAGTCCATTGAGGCTG3′（双下划线部分为引入的EcoRⅠ 酶切位点，粗体字为引入的起始密码子）；
下游引物P-5′GCGAAGCTTCTAGTTCCTCTTGATTTGCTCC3′（双下划线部分为引入的Hind Ⅲ 酶切位点，粗体字为引入的终止密码子）．
1.2.2 目的基因PCR扩增 采用Trizol一步抽提法提取鳜鱼肌肉组织的总RNA后根据反转录试剂盒（Fermentas）合成第一链cDNA，并以其为模板进行PCR扩增．PCR扩增条件为：94 ℃预变性 5 min； 94 ℃变性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35个循环；72 ℃反应10 min．PCR产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测后用DNA胶回收试剂盒进行纯化．
1.2.3 原核表达载体构建 pET32a质粒经EcoRⅠ和Hind Ⅲ 双酶切处理回收后与同种酶双酶切后的PCR纯化产物在T4 DNA连接酶的作用下16 ℃过夜，将目的基因定向连接到pET32a载体上，再转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞，接种于含50 mg/L氨苄青霉素LB固体培养基平板上37 ℃过夜培养，挑取单菌落进行菌落PCR鉴定，提取质粒进行双酶切鉴定，挑选阳性克隆送上海生工生物有限公司测序．
1.2.4 重组质粒的原核表达及重组蛋白的纯化 把构建好的表达载体pET32aMyHC转化到大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，取单个菌落接种到LB液体培养基中，37 ℃振荡过夜，取上述培养物以体积比1∶ 100比例接种于200 mL LB液体培养基，37 ℃振荡培养3 h左右，至OD600 值达0.5时，取1 mL菌液作为诱导前对照，分别加入终浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.2 mmol/L的IPTG，37 ℃分别诱导1、2、3、4、5 h，收集菌液进行150 g/L SDSPAGE电泳，观察不同IPTG浓度和诱导时间对目的蛋白表达量的影响．
1.2.5 抗血清的制备 用 NiNTA 纯化表达的鳜鱼MyHC融合蛋白，然后将纯化的MyHC融合蛋白皮下多点注射新西兰兔，共免疫3次．注射的抗原均为MyHC蛋白与弗氏完全佐剂按体积比1∶ 1混合液．首次免疫后，每隔两周加强免疫一次．末次加强免疫后两周采集少量血液，ELISA检测血清抗体效价．之后，颈动脉放血，离心分离血清，即得到鳜鱼MyHC蛋白的多克隆抗体，分装后-80 ℃保存．
1.2.6 Western blot分析抗体特异性 使用哺乳动物细胞蛋白提取试剂盒提取鳜鱼肌肉组织总蛋白，-20 ℃保存备用．分别取空白质粒pET32a细菌裂解液、鳜鱼肌肉总蛋白、纯化的MyHC蛋白，经100 g/L SDSPAGE电泳后湿法转到NC膜上，使用50 g/L脱脂奶粉/TBST 4 ℃封闭过夜．加入一抗（兔抗MyHC血清，浓度比1∶ 1 000稀释）4 ℃过夜孵育，TBST清洗3次后加入二抗（HRP标记的羊抗兔IgG，浓度比1∶ 2 000稀释），TBST清洗，HRPDAB显色，至出现明显条带后终止反应．
1.2.7 免疫组化分析抗体的特异性 石蜡切片脱蜡、水化；3%（体积分数）H2O2 室温孵育15 min；蒸馏水冲洗，微波炉内抗原修复15 min；自然冷却后，蒸馏水冲洗；PBS冲洗3次，每次5 min；50 g/L BSA室温封闭30 min；倾去封闭液，滴加浓度比1∶ 2 000稀释的兔抗MyHC多克隆抗体（一抗），室温孵育1 h；PBS冲洗3次，每次5 min；滴加二抗生物素标记兔IgG（浓度比1∶ 1 000），室温孵育20 min；PBS冲洗3次，每次5 min；BCIP/NBT显色；自来水冲洗，核固红轻度复染，水洗，干燥后水溶性封片剂封片，镜检．用PBS代替一抗作为阴性对照．
2 实验结果
2.1 重组表达载体pET32aMyHC的构建
将重组表达质粒pET32aMyHC经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切鉴定结果如图1．其中，大于4 500 bp条带为酶切载体大小，500 bp左右的条带为目的基因片段大小．同时以单菌落为模板，经菌落PCR鉴定，结果如图2，可见在500～600 bp间有一条明显的特异条带。
2.2 鳜鱼MyHC原核表达及条件优化
将重组表达载体pET32aMyHC（实验组）和空载体pET32a（对照组）转化到宿主菌BL21中，分别利用IPTG诱导，经SDSPAGE检测结果如图3和图4．其中，对照组显示一条相对分子质量约为17 000的特异性条带，即为pET载体的His标签蛋白；而实验组在相对分子质量约40 000处出现一条较明亮的条带，即为HisMyHC融合蛋白．His标签蛋白的相对分子质量约为17 000，而插入的小清蛋白目的片段预测其蛋白相对分子质量大约为25 000，因此，MyHC融合蛋白的相对分子质量理论上接近40 000，这与SDSPAGE电泳结果一致，表明重组表达质粒pET32aMyHC经IPTG诱导后在大肠杆菌BL21中成功表达出HisMyHC融合蛋白．
M：蛋白Marker ； 1～5：不同IPTG浓度诱导的含pET32aMyHC的BL21菌体，其IPTG浓度依次为0，0.2，0.6，0.8，1.2 mmol/L；6：0.8 mmol/L IPTG诱导的含pET32a的BL21菌体
为了获得稳定的目的基因片段和可溶状态的重组蛋白，克隆片段起始位置应位于保守性较高且亲水性高的区域．作者在设计引物前利用DNAstar软件对鳜鱼肌球蛋白重链基因进行亲/疏水性预测［16］，结果显示鳜鱼肌球蛋白重链基因亲水性氨基酸多集中于850～1 983位．分析鳜鱼MyHC的保守结构［17］，作者选择在Myosin_tail_1亲水性氨基酸集中的区域（1 404～1 592位氨基酸）对应的核苷酸序列进行克隆和表达．基因的高效表达是在载体、基因和受体细胞的协同作用下完成的，主要受启动子、SD序列、转录终止序列、载体系统等因素的影响［1821］．宿主的选择及培养条件的控制等因素对外源基因在原核细胞中的表达效率也有很大影响．本实验所选用的表达载体大肠杆菌BL21具有T7启动子，可通过化学诱导高效地表达外源蛋白，目的蛋白前端的促溶蛋白（相对分子质量约为17 000）可以增加蛋白的表达及可溶性．同时，BL21含有6个组氨酸标签，可以提高外源表达蛋白的表达效率而不影响目的蛋白的高级结构，从免疫组化和免疫印迹结果来看， 作者表达出的带有His标签的蛋白也没有影响到抗原抗体特异结合的性质［22］．同时多聚组氨酸标签对外源重组蛋白的纯化也具有一定的作用．
进行融合蛋白诱导时， 蛋白极易以包涵体的形式表达， 而包涵体形成后的缺点是需变性、 复性等复杂处理过程后才能得到可溶性融合蛋白质．为了避免变性复性等复杂过程，通过改变诱导的时间和 IPTG的浓度，摸索到最适宜的条件为0.8 mmol/L IPTG诱导3 h．
肌球蛋白重链（ MyHC）具有ATPase活性、肌动蛋白结合位点以及a螺旋卷曲螺旋尾部等重要特性，是决定肌纤维收缩性质的主要分子之一．本研究以前期研究中已经克隆的鳜鱼MyHC序列［2324］为目的基因，利用大肠杆菌BL21作为表达载体，对目的基因进行原核表达载体的构建和多克隆抗体的制备．研究成果为进一步研究肌球蛋白重链对肉质的影响，提高优良肉质性状提供理论支持．
参考文献：
［1］ SELLERS J R， GOODSON H V， WANG F. A myosin family reunion［J］. J Muscle Res Cell Motil， 1996，17（1）： 722.
［2］ HOOPER S L， THUMA J B. Invertebrate muscles： muscle specific genes and proteins［J］. Physiol Rev， 2005，85（3）：10011060.
［3］ MUNAKATA T. Crystal engineering using multiple hydrogen bonds［J］. Tetrahedron Lett， 2004，108（38）：5596.
［4］ WEEDS A G. Light chains from slowtwitch muscle myosin［J］. Eur J Biochem， 1976，66（1）：157173.
［5］ STREHLER E E， STREHLERPAGE M A， PERRIARD J C， et al. Complete nucleotide and encoded amino acid sequence of a mammalian myosin heavy chain gene. Evidence against introndependent evolution of the rod ［J］. J Mol Biol， 1986，190（3）：291317.
［6］ MOLINA M I， KROPP K E， GULICK J， et al. The sequence of an myosin heavy chain gene and isolation of its corresponding cDNA ［J］. J Biol Chem， 1987，262（14）：64786488.
［7］ JAENICKE T， DIEDERICH K W， HAAS W， et al. The complete sequence of the human betamyosin heavy chain gene and a comparative analysis of its product［J］. Genomics， 1990，8（2）：194206.
［8］ BRYSONRICHARDSON R J ， DAGGETT D F， CORTES F， et al. Myosin heavy chain expression in zebrafish and slow muscle composition［J］. Dev Dyn， 2005，233（33）：10181022.
［9］ MC GUIGAN K， PHILLIPS P C， POSTLETHWAIT J H. Evolution of sarcomeric myosin heavy chain genes： evidence from fish［J］. Mol Biol Evol， 2004，21（6）：10421056.
［10］ MURAMATSUUNO M， KIKUCHI K， SUETAKE H， et al. The complete genomic sequence of the carp fast skeletal myosin heavy chain gene ［J］. Gene， 2005，349（11）：143151.
［11］ LEID E A， VON DER DECKEN. Purification of fish muscle myosin heavy chain and quantification of the specific polyribosomebond polypeptide［J］. Biochem J， 1985，232（2）：467470.
［12］ ZHANG J S， CHU W Y， CHEN J， et al. cDNA cloning and expression analysis of myosin heavy chain gene（MHC）of the Mandarin fish， Sniperca kneri ［J］. Aquacuture Reseach， 2009，40（4）：412418.
［13］ CROCKFORD T， JOHNSTON I A. Isolation of unstable myosins and the analysis of light chains by capillary electrophoresis［J］. Anal Biochem， 1995，231（1）：2026.
［14］ GOLDSPINK G， TURAY L， HANSEN E， et al. Switches in fish myosin genes induced by environment temperature in muscle of the carp［J］. Symp Soc Exp Biol， 1992，46：139149.
［15］ KATO S， KONNO K. Filamentforming domain of carp dorsal myosin rod［J］. J Biochem， 1993，113（1）：4347.
［16］ BARTLETT G J， TODD A E， THORNTON J M. Inferring protein function from structure［J］. Methods Biochem Anal， 2003，44：387407.
［17］ 符贵红.鳜鱼肉质营养成分分析及肌球蛋白重链基因克隆与表达［D］.长沙：湖南农业大学， 2007.
［18］ SHINE J， DALGARNO L. Terminalsequence analysis of bacterial ribosomal RNA. Correlation between the 3′terminalpolypyrimidine sequence of 16S RNA and translational specificity of the ribosome［J］. Eur J Biochem， 1975，57（1）：221230.
［19］ STUDIER F W， MOFFATT B A. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective highlevel expression of cloned genes［J］. J Mol Biol， 1986，189（1）：113130.
［20］ 赵发兰，周瑞雪，成 嘉，等.鳜鱼与鲢鱼肌球蛋白轻链2启动子的克隆及其序列比较分析［J］.湖南师范大学自然科学学报， 2011，34（1）：7579.
［21］ 农小献，赵发兰，宾石玉，等.斑鳜轻链3基因（MLC3）cDNA的克隆及纵向表达分析［J］.湖南师范大学自然科学学报， 2011，34（2）：7983.
［22］ 宋小燕， 耿梅梅， 褚武英， 等. 从大肠杆菌中表达、纯化宁乡猪N乙酰谷氨酸合成酶并制备其多克隆抗体［J］. 激光生物学报， 2008，17（6）：750755.
［23］ CHU W Y， FU G H， CHENG J， et al. Gene expression profiling in muscle tissues of the commercially important teleost， SiniPerca chuatsi L［J］. Aquacul Int， 2010，18（4）：667678.
中图分类号：G804.7
文献标识码：A
文章编号：1007-3612(2011)02-0052-03
人体及各种动物骨骼肌肌球蛋白重链亚型(I型、IIa、IIx和IIb型)存在差异，例如人类缺乏小动物的快IIb亚型蛋白表达，某些大型动物亦与人类相似，固收缩特性亦有很大差别，必须做蛋白水平及基因水平的比较研究，才能弄清骨骼肌收缩的机制。目前国内外关于人和不同动物MHC亚型的比较研究很薄弱，本文从基因表达的角度作初步探索，为下一步进行蛋白水平的比较测定作准备，具有特定的意义。
1 研究方法
1.1动物分组、取样及处理选用清洁级健康雄性SD大鼠6只(购于扬州大学比较动物中心)，6周龄，体重135～150g，作为对照；另选家兔6只，均用戊巴比妥钠腹腔或静注麻醉，宰杀，迅速选取股外侧肌样本。
人的股外侧肌标本少许，取自扬州市某医院，数名腿部外科手术自愿者(事先说明了采样的重要性，因取样极少，手术自愿者很支持；且人的肌肉组成及收缩性能与动物差异较大，相互比较对揭示其收缩性能更有意义，因此采样很必要)。牛的样本取自屠宰现场，亦为股外侧肌，迅速用TRI－ZOL试剂匀浆固定、待测。
1.2测定方法每组取6个样本，用于肌球蛋白重链，(MHC)亚型基因表达的测定。
由上海康成生物公司共同完成Realtime PCR反应。
试剂购于Invitrogen公司，先进行总RNA提取，逆转录按试剂盒说明书操作。
不同梯度的DNA模板，以及eDNA样品分别配置反应体系。PCR反应溶液放于Realtime PCR仪上进行反应。
反应条件是：94℃，5min；35个PCR循环(94℃，10s；58℃，15s；71℃，20s；84℃，5s，收集荧光)。为建立PCR产物熔解曲线，扩增结束后继续从71℃缓慢加热至99℃(每5s升高1℃)。
然后根据标准曲线、熔解曲线及扩增曲线图获得实验数据，使用管家基因ppia(不同样品之间表达量保持基本恒定)作内参，待测基因以内参校正(表1)。
1.3数据统计实验数据均用“均值±标准差”表示，统计、分析用SPSS 15软件进行，组间比较使用独立样本T检验，P
2 结果
从表2结果可见：未经内参较正的测定值，人、牛、兔的肌球蛋白重链(MHC)亚型及成肌调节因子(MRFs)基因表达均明显低于大鼠(P
3 讨论
3.1不同动物骨骼肌MHC亚型的差异以往的研究显示，人和马等大型动物骨骼肌中未发现有IIB蛋白表达，但有相应的基因存在，人的IIB亚型的基因编码已出现在人类基因组，定位于染色体17上。Graziotti等(2001)用6种单克隆抗体(MABs)比较了三种动物(鼠、马、骆驼)MHC亚型的反应及显色，结果显示，LIB纤维在大哺乳动物如骆驼肌肉中也有表达，且可以是纯合形态，也可以杂合分布。骆驼肌纤维杂合型IIXB、IIAXB比例较高。有关人类与动物的骨骼肌比较研究很缺乏，本研究对此作一探索，为后续研究作准备，具有其特定的意义。
骆驼与大鼠相似，肌纤维的大小、氧化类型：TIB>IIX>IIA，糖酵解能力IIA>IIX>IIB。SDH活性IIB较低(但狗的IIB纤维具有很高的有氧能力)。
另外，全身各部位肌肉的肌纤维类型存在差异，骆驼后肢几种肌肉的II型纤维很高，超过90％，其中IIB比例亦很高，在半腱肌达49.2％；
另据报道，猪的背最长肌MHC IIB转录占67％，但在半腱肌的红肌(慢肌为主)部分则没有表达。但Tanabe等(1999)报道，猪背最长肌MHC IIB转录仅占30％，但在半腱肌的白肌部分占60％。MHC IIB转录的表达在猪的舌肌、膈肌没有发现(主要是慢肌组成)。
本研究初步探索人与几种动物在基因表达水平的交叉及基因相似性，结果在同一大鼠引物下，人的MHC各亚型基因表达与大鼠含量较接近，有一定的交叉和基因相似性；而牛的含量虽可检出，但仍明显低于大鼠含量(P
3.2运动训练对骨骼肌MHC亚型的基因表达影响运动训练对骨骼肌MHC及基因表达的影响随着运动持续的时间及运动强度不同而有不同的变化。Allen等(2001)报道了小鼠心肌和骨骼肌对滚轮耐力运动的适应变化。结果显示，在骨骼肌，无论采用电泳还是组化方法，运动2周后腓肠肌和胫前肌表达MHC IIa的肌纤维百分数均明显升高；4周运动后两种肌肉表达MHC IIb的肌纤维百分数则明显降低，呈现MHC IIb向IIa表达的转变，即“由快到慢”的变化趋势。Bigard等(1999)研究了五周耐力训练对雄性Wistar大鼠趾长伸肌的MHC的影响，结果表明，MHC I、Ⅱa和Ⅱx含量耐力组明显高于对照组，同时MHEIIb的浓度则相应有所下降，即呈现“由快到慢”的变化趋势。潘同斌(2005)年报道，急性低氧或力竭运动后，MHC各亚
型mRNA的表达量总体上表现为上升趋势。另一方面，MHC各亚型mRNA所占百分比的分析显示，一次力竭性运动可能刺激MHC mRNA的表达出现“由快到慢”的变化趋势。Holm L(2008)报道了重负荷和轻负荷强度抗阻训练对人股四头肌的体积及MHC组成的影响。结果显示，重负荷组(70％最大负荷)在12周后出现骨骼肌肥大，且快MHC IIx亚型的蛋白表达下降；而轻负荷组(15.5％最大负荷)的变化不显著。
本文暂未涉及运动模型下的骨骼肌MHC亚型变化，关于人与不同动物在运动模型下骨骼肌肌纤维类型变化的比较研究有待进一步深入。
3.3运动训练对成肌调节因子的影响肌细胞损伤后的再生由一群单核细胞，即卫星细胞来执行，卫星细胞在未损伤的肌肉以静息细胞的形式存在，但它在受损伤肌肉处被激活，分化并修复损伤。肌卫星细胞激活及成肌细胞的分化受到MyoD家族的螺旋－环－螺旋结构的转录因子的调节，运动训练对成肌调节因子的影响也日益受到重视。
Merete Ekmark等(2007)研究表明，成肌调节因子(MRFs)作为骨骼肌表达的重要调节途径，MyoD在快肌中的表达较高，而慢肌中myogerin表达水平较高；MyoD由于去磷酸化而被激活，可促进鼠类动物骨骼肌的快MHC表达；而慢肌中，MyoD则由于磷酸化而处于失活状态，同时，慢频率的电刺激有着相似的效应；可见不同的成肌调节因子对快、慢肌的表达有针对性的调节作用。Peterson JM(2008)比较研究了瘦鼠和肥胖鼠卫星细胞分化的强弱，以及负荷运动对其影响。结果显示，肥胖鼠由于卫星细胞分化较弱而出现肌肉含量较少，同时成肌调节因子Myogenin，MyoD，and Akt的蛋白表达也比较低；但负荷运动可以改善上述变化，能起到一定的补偿作用。
曾缨等(2004)观察了成肌调节因子MyoD和myogenin在肌肉损伤修复过程中的动态变化，结果显示myogenin则在肌肉损伤后24h开始表达，72h达到峰值；MyoD在肌肉损伤后18h开始表达，48h达到峰值。由此可见，MyoD和myogenin在肌肉损伤后的修复再生过程中起着重要作用，可作为鉴定骨骼肌前体细胞和反映肌肉修复再生的指标。Siu等(2004)研究报道，在耐力训练8周后，大鼠比目鱼肌中myogenin和氧化酶的基因表达明显提高，且二者呈现正相关。其中myogenin mRNA的表达升高25％，myo－genin／MyoD mRNA的比值则升高28％；Western Blotting测定显示，蛋白水平的表达也有相应的增高。
Willoughby等(2002)研究了一次重阻力训练课对人体MHC亚型mRNA及转录因子MyoD、myogenin及Id-1mRNA表达的影响。结果显示，训练组在运动后6h，MHC I型、IIa和IIx mRNA分别提高了38.19％、45.61％和74.24％(P
关于不同运动模型下，成肌调节因子(MRFs)的变化及其对骨骼肌MHC亚型的调节机制，亦有待进一步研究。
4 结论
关键词：过度训练；骨骼肌；肌球蛋白重链（MHC）亚型；基因表达
中图分类号：G804.7文献标识码：A文章编号 ：1007-3612(2009)04-0061-03
Influences of Overtraining on the Gene Expression of Myosin He avy Chain (MHC) Isoforms in Rats' Skeletal Muscle
PAN Tongbin1, DING Lasheng1, MAO Shanshan2, SUN Wenji1
(1. Physical Education College, Yangzhou University, Yangzhou 2 25002, Jiangsu China; 2. Beijing Sport University, Beijing 100084, China)
Abstract: Objective: To explore the influences of overtraining on the gene expr ession of myosin heavy chain (MHC) isoforms in rats' skeletal muscle, and to sup ply some basis for further research on its mechanism of level of protein and gen e. Method: 20 male SD rats are divided into 2 groups randomly: A. Control, n=10,B. Overtraining, OT, n=10. The OT Group carries on the heavyload running ex er cise to exhaustion for 8 weeks. Then both groups are killed at quiet situation.The vastus lateralis samples are selected and preserved in liquid nitrogen quick ly. The mRNA gene expression of the four MHC isoforms of the skeletal muscle ismeasured by realtime PCR. Results: The gene expression of MHC isoforms measure d by realtime PCR shows that the overtraining group is apparently higher tha n the quiet control group in MHC I mRNA and MHC IIb mRNA (P0.05). Percentage change in gene expression of MHC isoforms at rest afte r treadmill training is similar. The trend of “from quick to slow" exists. Thechanges of isoforms are not consistent and are selective on this exercise model.This supplied basis for further research on the regulation mechanism of myogeni c regulation factors (MRFs).
Key words: overtraining；skeletal muscle；myosin heavy chain (MHC )i soforms；gene expression
目前，国内关于运动训练对骨骼肌肌球蛋白重链（myosin heavy chain, MHC）亚型影响的 研究很少；国外研究也很不充分，且存在争议[1-3]。Rinaldi C[1]研究 发现，4 d间歇抗阻练习可使大鼠腓肠肌快肌成分由快MHC IIb 型向 IIx型转变，且此种转 变发生在前mRNA及mRNA水平，且与IG双向调节子有关。Kesidis N[2]通过骨骼肌蛋 白 电泳及组化方法观察，发现长期高强度抗阻训练后，健身者股外侧肌MHC I/IIA上升，IIX下 降，提示发生“由快变慢”的变化趋势，ATP酶组化分析结果相似，快IIX型所占百分率下降 。但Kryger AI and Andersen JL[3]观察了12周抗阻训练对老年人肌肉力量、肌纤 维及MHC亚型的影响，结果训练组股四头肌II型肌纤维横断面积增加，I型百分比降低；同时 MHC IIa亚型增加，MHC I亚型降低，显示“由慢到快”的变化趋势，有助于肌肉力量的增加 。由此可见，不同运动模式和运动负荷可导致肌纤维类型发生不同转变[4-6]，其 机制有待进一步探索。
本文参照郑陆等人建立的大鼠跑台过度训练模型[7]，骨骼肌MHC亚型的基因表达测 试采用较 先进的实时荧光PCR测定，结果更为精确 。旨在观察大运动量耐力训练对大鼠骨骼肌肌球蛋 白基因表达的影响，通过检测肌球蛋白重链（MHC）各亚型mRNA的变化，为下一步研究成肌 调节因子的调节机制提供依据，对揭示骨骼肌的收缩机制有着重要的理论及实践意义。
1 研究方法
1.1 动物分组及处理
选用清洁级健康雄性SD大鼠20只（购于扬州大学比较动物中心），6周龄，体重135～150 g ，随机分为2组。A、安静对照组（Control，n=10），B、过度训练组（Over-training，OT ，n=10）。
训练方案 参照郑陆[7]等人建立的大鼠跑台过度训练模型。每次从15 m/min开始， 每5 min速度增加5 m/min,直至40 m/min,保持此强度至力竭，运动时使用小木棍刺激动物尾 部，必要时采用一定的声音刺激或电刺激，使动物保持在跑道前1/3处，以保证运动强度。 个别大鼠被淘汰。 8周后，两组大鼠在第二天早晨用戊巴比妥钠腹腔或静注麻醉，宰杀，迅 速选取股外侧肌样本液氮保存。
1.2 测定方法肌球蛋白重链（MHC）亚型基因表达测定，每组取6个样本。
先进行总RNA提取，逆转录（RT）按试剂盒说明书进行，试剂购于Invitrogen life technol ogies公司。
Realtime PCR反应，由上海康成生物公司合作完成。
几个梯度稀释的DNA模板以及所有cDNA样品分别配置Realtime PCR反应体系。PCR反应溶液置 于Realtime PCR仪上进行PCR反应。
反应条件：95℃，5 min；35个PCR循环（95℃，10 s；59℃，15 s；72℃，20 s；85℃，5s，收集荧光）。为了建立PCR产物的熔解曲线，扩增反应结束后继续从72℃缓慢加热到99 ℃（每5 s升高1℃）。
根据标准曲线、熔解曲线及扩增曲线图得实验数据，待测基因以内参校正，使用管家基因pp ia（不同样品间表达量基本恒定）作为内参。
引物列表：
1.3 数据处理
所有实验数据均以“均差±标准差”表示，统计分析用SPSS 13软件完成，组间比较采用独 立样本T检验， P
2 结 果
大鼠骨骼肌肌球蛋白重链（MHC）亚型基因表达结果，系各样品的基因量以内参校正（用管 家基因ppia）的统计结果。
由表1可见，经过8周的跑台训练，MHC各亚型的基因表达不尽相同，具有选择性。其中MHC I Ia 和MHC IIx mRNA训练后无明显的变化，但MHC I 和MHC IIb mRNA表达较对照组显著增加 （P
由表2可见，MHC各亚型所占百分比亦有相应的变化，即训练组MHC I 和MHC IIb mRNA百 分比较对照组显著增加，而MHC a 和MHC IIx mRNA百分比则略有下降。由于慢I型比例很小 ，从快II亚型来看，可见“由快变慢” 的变化趋势。
3 分析与讨论
3.1 运动训练对大鼠骨骼肌MHC亚型基因表达的影响运动训练对骨骼肌MHC及其基因表达的影响随运动持续的时间及运动的强度不同而有不同的 变化。Holm L[8]研究了重负荷和轻负荷强度的抗阻训练对人股四头肌体积及MHC组 成的影响。结果重负荷阻（70%最大负荷）12周后出现骨骼肌肥大，且快MHC IIx亚型蛋白表 达下降；而轻负荷组（15.5%最大负荷）变化不明显。Kryger AI and Andersen JL[3 ]观察了12周抗阻训练对老年人肌肉力量、肌纤维及MHC亚型的影响，结果训练组股四头 肌II型肌纤维横断面积增加，I型百分比降低；同时MHC II a亚型增加，MHC I亚型降低，显 示“由慢到快”的变化趋势，有助于肌肉力量的增加。Bigard等[9]观察了五周 耐 力训练对雄性Wistar 大鼠趾长伸肌MHC 的影响，结果显示MHC Ⅰ、Ⅱa 和Ⅱx 含量耐力组 明显高于对照组，同时MHCⅡb 浓度相应有所下降，即呈现“由快到慢”的变化趋势。Allen等[6]观察了小鼠心肌和骨骼肌对滚轮耐力运动的适应。结果在骨骼肌，无论采用 电泳及组化方法, 运动2 周后表达MHC IIa 的肌纤维百分数在腓肠肌和胫前肌均明显升高； 4周运动后表达MHC IIb的肌纤维百分数在两种肌肉中则明显降低，出现MHC IIb 向IIa 表达 的转变, 即“由快到慢”的趋势。潘同斌[10]年报道，急性低氧或力竭运动后，M HC各亚型mRNA表达量总体上表现为上升趋势。另一方面，MHC 各亚型mRNA所占百分比分析显 示,一次力竭运动可能刺激MHC mRNA 表达出现“由快到慢”的趋势。
本实验模型下，过度训练组和安静对照组大鼠相互比较，MHC I mRNA运动训练组明显高于 安静对照组（0.01＜P＜0.05）；MHC IIx mRNA 及MHC IIa mRNA过度训练组和安静对 照 组大鼠比较，无明显差异（P＞0.05）；MHC IIb mRNA 过度训练组亦明显高于安静对照 组，且差异较明显（P＜0.01）。提示本运动模型引起各亚型的基因表达变化不是均衡 的，具有选择性，主要表现为MHC I及MHC IIb mRNA的含量增多，即亚型两端的变化较明显 ，而中间类型的变化不明显。另一方面，MHC各亚型mRNA所占百分比的变化与上述含量变化 比较一致，即训练组MHC I 和MHC IIb mRNA百分比较对照组显著增加，而MHC IIa 和MHC II x mRNA百分比则略有下降。由于慢I型比例很小，从快II亚型来看，可见“由快变慢” 的变 化趋势（即快IIb下降，而IIa 和MHC IIx上升），与本人以前的报道及大多数文献报道比较 一致。此外还需进一步做蛋白水平亚型百分比的测定、分析。并且，对于耐力训练影响其变 化的具体因素，还需要做进一步的后续研究。而成肌调节因子作为影响其变化的重要内在因 素，有必要重点关注，本实验为下一步研究成肌调节因子的调节机制提供了依据。
3.2 运动训练对成肌调节因子（MRFs）的影响肌卫星细胞的激活和成肌细胞分化受MyoD家族的螺旋-环-螺旋结构的转录因子调节[11 ]，这 些成肌调节因子（myogenic regulatory factors ，MRFs）包括MyoD、Myogenin、Myf5、MR F4。肌肉损伤后，Myf5和MyoD首先在再生肌细胞中表达，紧接着是Myogenin，最后是MRF4表 达。肌肉损伤后的再生由一群单核细胞，即卫星细胞执行，卫星细胞在未损伤肌肉以静息细 胞形式存在，但在受损伤肌肉被激活，分化以修复损伤。运动对成肌调节因子的影响也越来 越受到重视。
Peterson JM[12]比较观察了瘦鼠和肥胖鼠在卫星细胞分化的强弱，及负荷运动 的作用。结果肥胖鼠由于卫星细胞分化较弱而肌肉较少，同时成肌调节因子Myogenin, MyoD , and Akt蛋白表达亦较低；但负荷运动可改善上述变化，起到一定的补偿作用。Merete Ek mark等[13]观察到，成肌调节因子作为骨骼肌表达的重要调节通道，MyoD在快肌中 表达较高，而慢肌中myogenin水平较高；MyoD去磷酸化而被激活，可促进鼠类骨骼肌快MHC 表达；而在慢肌中，MyoD由于磷酸化而处于失活状态，慢频率的电刺激有相似效应；可见不 同成肌调节因子对快、慢肌的表达有着针对性的调节作用。
Willoughby等[14]观察了一次重阻力训练课对人体MHC亚型mRNA及转录因子 myog enin、MyoD 和Id-1mRNA表达的影响。结果练习组在运动后6 h，MHC I型、IIa和IIx mRNA分 别提高38.19%、45.61%和74.24%(P
Siu等报道[15]，耐力训练8周后，大鼠比目鱼肌中myogenin及氧化酶基因表达明显 提高，且二者成正相关。其中myogenin mRNA升高25%，myogenin/ MyoD mRNA比值升高28%； Western Blot 分析显示，蛋白水平亦有相应的增高。曾缨等探讨了成肌调节因子MyoD与myo genin在肌肉损伤修复过程中的动态表达[16]，结果MyoD在肌肉损伤后18 h开始表 达,48 h达高峰;myogenin在肌肉损伤后24 h开始表达,72 h达高峰。可见MyoD与myogenin在 肌肉损伤后的再生修复过程中起作用,可作为鉴定肌肉前体细胞和反映肌肉再生的指标。
关于本运动模型下，成肌调节因子的变化及其对MHC亚型的调节机制，有待进一步研究。
4 结 论
实时荧光PCR测定显示，本运动模型下，过度训练组MHC I型 mRNA 及MHC IIb型mRNA 明显增 加，而MHC IIx mRNA 及MHC IIa mRNA变化不明显增加；另一方面，MHC各亚型所占百分比亦 有相应的变化，即训练组MHC I 和MHC IIb mRNA百分比较对照组显著增加，而MHC IIa 和MH C IIx mRNA百分比则略有下降。由于慢I型比例很小，从快II亚型来看，可见“由快变慢”的变化趋势。可见运动引起MHC各亚型的基因表达变化不是均衡的，具有选择性，可能与不 同成肌调节因子的针对性作用有关，这就为下一步研究成肌调节因子的调节机制提供了依据 。
参考文献：
［1］Rinaldi C, Haddad F, Bodell PW, etal.Intergenic bidirectional promoter and co operative regulation of the IIx and IIb MHC genes in fast skeletal muscle. AmJ Physiol Regulatory Integrative Comp Physiol，2008，295(1):R208-R218.
［2］ Kesidis N, Metaxas TI, Vrabas IS, etal.Myosin heavy chain isoform distribu ti on in single fibres of bodybuilders.European journal of applied physiology， 2008,103(5):579-83.
［3］ Kryger AI and Andersen JL.Resistance training in the oldest old: consequen cesfor muscle strength, fiber types, fiber size, and MHC isoforms.Scandinavian j ournal of medicine & science in sports，2007,17(4):422-30.
［4］ Sullivan VK, et al. Myosin heavy chain composition in young and old rat sk el etal muscle: effects of endurance exercise. J Appl Physiol，1995，78(6):2115 -2120.
［5］ Andersen JL, et al. Myosin heavy chain isoforms in single fibres from m.va stu s lateralis of sprinters: influence of training. Acta Physiol Scand，1994，1 51:135-142.
［6］ Allen DL, et al. Cardiac and skeletal muscle adaptations to voluntary whee l running in the mouse. J Appl Physiol，2001，90:1900-1908.
［7］ 郑陆，隋波，潘力平，等.过度训练动物模型的建立［J］.中国运动医学杂志，2000 ，19（2）：179-181.
［8］ Holm L, Reitelseder S, Pedersen TG,etal.Changes in muscle size and MHC com pos ition in response to resistance exercise with heavy and light loading intensity. Journal of applied physiology，2008,105(5):1454-61.
［9］ Bigard AX，Janmot C ,Sanchez H ,Serrurier B ,Pollet S ,d’Albis AChangesinmyosin heavy chain profile of mature regenerated muscle with endurance trainingin rat［J］.Acta Physiol Scand，1999,165(2)：185-192.
［10］ 潘同斌，等．急性低氧及力竭运动对大鼠骨骼肌肌球蛋白重链(MHC) 亚型基因表达 的影响［J］.体育科学，2005，25（1）：30-33.
［11］ Grace KP, Janice AD，et al. Regeneration of transgenic skeletal muscles w ithaltered timing of expression of the basic Helix-Loop-Helix muscle regulatory fa ctor MRF4. America Journal of Pathology，2003,162: 1685-1691.
［12］ Peterson JM, Bryner RW, and Alway SE. Satellite cell proliferation is red uce d in muscles of obese Zucker rats but restored with loading.Am J Physiol CellPhysiol，2008，295(2):C521-C528.
［13］ Merete Ekmark, Zaheer Ahmad Rana, etal. De-phosphorylation of MyoD is lin kin g nerve-evoked activity to fast myosin heavy chain expression in rodentsk eletal muscle. J Physiol，584(2):637-650.
［14］ Willoughby DS, et al. Myosin heavy-chain mRNA expression after a single s es sion of heavy-resistance exercise ［J］. Med Sci Sports Exerc,2002,34(8):126 2-1269.
［15］ Siu PM, Donley DA, Bryner RW, Alway SE. Myogenin and oxidative enzyme gen eexpression levels are elevated in rat soleus muscles after endurance training.J Appl Physiol,2004,97(1):277-285.