基于位点特异性PCR的黄芪与红芪鉴别方法研究

[摘要] 研究黄芪与红芪药材之间的DNA分子鉴别方法。采集不同产地的黄芪药材30份、红芪28份，所有样品进行总DNA的提取，通过对黄芪及红芪药材 trn L-trn F片段进行扩增、测序，进行同源比对后根据其变异位点设计特异性鉴别引物。并对位点特异性PCR方法进行条件优化。通过使用特异性引物对所有样品进行PCR扩增，发现黄芪可扩增出136 bp 片段，红芪可以扩增出323 bp片段。黄芪中掺入10% 以上红芪可以扩增出红芪特异鉴别条带。通过位点特异性PCR的方法实现了黄芪与红芪药材的快速、准确鉴别。

[关键词] 黄芪；位点特异性PCR；分子鉴定

[收稿日期] 2013-03-07

[基金项目] 国家“十二五”科技支撑计划项目（2012BA128B02）；中医药行业科研专项 （201107009）；包头科技发展项目（2011X1002）

[通信作者] * 李旻辉，博士，教授，主要从事蒙药分子鉴定与资源保护研究，Tel： （010） 64014411-2956， E-mail： ；* 周立社，教授，主要从事分子生物学研究，Tel： 13604726512， E-mail： 临床常用中药黄芪是豆科植物蒙古黄芪 Astragalus membranaceus （Fisch.） Bge. var. mongholicus （Bge.） Hsiao或 膜荚黄芪 A. membranaceus （Fisch.） Bge的干燥根[1]。始载于《神农本草经》，传统中医药理论认为黄芪， 性味甘、微温，具有补气固表、利水生津、托毒排脓、生肌等功效[1]。现代医学研究表明黄芪有强心、利尿、降压、抗菌、提高机体免疫功能和促进新陈代谢等作用[2-3]。由于近几年黄芪有效成分的深入研究，作为药食两用的黄芪资源得到了广泛的开发和利用，使得市场对黄芪资源的需求急剧增加。市场上除了正品黄芪外，尚有代用品、伪品和混淆品。而在中医临床用药中，黄芪和红芪通常混用并相互替代，其中红芪是豆科植物多序岩黄芪 Hedysarum polybotrys Hand.-Mazz. 的干燥根，其根茎在外形上与黄芪极为相近，但是质量差异较大。因此，建立一种用于快速、准确鉴别黄芪药材的方法对于保障人民用药安全意义重大。

黄芪药材鉴别的方法较多， 鉴定手段也从原植物鉴别、性状鉴别、显微鉴定发展到应用色谱、光谱技术[4-6]。而对于黄芪与红芪的鉴别方法，有显微和色谱的方法曾被报道过[4，7]。目前市面上销售的黄芪多为加工过的药材， 而加工过的红芪药材或其伪品的表面性状、显微特征等与黄芪药材都较为相似[4-5，8]，在实际运用中要进行准确鉴别存在一定难度。同时应用形态学和组织学等方法来鉴定黄芪存在主观性较大、特异性不强、通用性差、对观察者经验的要求高等缺陷，不利于规范化、标准化方法的建立及普及。而DNA分子遗传标记技术具有快速、微量、特异性强的特点，近几年分子生物学中该技术的研究则为解决药材的鉴别问题提供了客观而有效的手段。对于黄芪分子鉴别方面，张曦等对中药材黄芪进行了DNA指纹图谱鉴别研究[9]，而前期课题组已经通过ITS序列差异分析对黄芪及其红芪等混伪品的遗传关系作初步的研究[10]，为了寻找更快速、准确、稳定的分子鉴别方法，对位点特异性PCR方法进行了研究。目前位点特异性PCR方法已成功用于中药材鉴定等方面的研究，如金银花、人参、陈皮等中药材的真伪鉴别[11-13]，因此本研究通过位点特异性PCR方法对黄芪及其混伪品红芪进行研究，为准确进行黄芪与其混伪品的鉴别提供科学的客观依据。

1 材料

2×CTAB提取液，1×TAE缓冲液，琼脂糖（Promega公司），溴化乙锭（Fluka公司），DNA Taq 聚合酶（Takara公司），2 000 bp DNA Markar（Takara公司），三氯甲烷﹑无水乙醇﹑异丙醇均为国产分析纯。

PCR仪（德国Eppendorf， 型号5332），电泳系统（北京市六一仪器厂，型号DYY-12），低温冷冻离心机（德国Eppendorf， 型号5810R），紫外凝胶成像分析仪（英国Syngene， 型号GBOXHR），混合型球磨仪（德国Retsch，型号MM400），数控超声波清洗器（型号KQ-500DE），微量移液器（德国Eppendorf）。

本实验选取58份材料包括采自内蒙古的黄芪18份；采自山西的黄芪5份；采自甘肃的黄芪5份；红芪28份，分别采自内蒙古和甘肃；以及2批购自市场上的黄芪药材。凭证标本保存于内蒙古科技大学包头医学院。名称﹑采集地点﹑序列号见表1。

表1 材料信息

Table 1 The sources of Astragali Radix and Hedysarum Radix

2 方法

2.1 鉴别引物的设计 选择通用引物 trn L-trn F对黄芪和红芪样品进行扩增[14]，然后使用BioEdit分析软件进行分析、校对处理，找出具有稳定差异的变异位点，进而筛选出黄芪和红芪的特有变异位点，根据其变异位点利用Primer Premier 5 软件设计2对位点特异PCR引物， 设计的2对特异引物扩增后片段大小分别为136，323 bp，具体引物设计示意图见图1，引物序列见表2。

图1 黄芪及红芪特异引物设计示意图

Fig.1 The specific primer design schematic diagram of Astragali Radix and Hedysari Radix

表2 引物及PCR反应条件

Table 2 Primer and PCR reaction conditions

2.2 总DNA的提取、PCR扩增条件的确定 分别取约100 mg干燥根作为材料，使用CTAB法提取总DNA。取不同样品DNA，终质量浓度大约为10 mg·L-1，使用通用引物 trn L和 trn F进行PCR反应以检测模板DNA质量。反应体系总体积为20 μL，包括10×buffer缓冲液2 μL， dNTP1.6 μL，引物各0.25 μL （5 pmol·L-1）， EX Taq 酶0.2 μL （5 U·μL-1），DNA 0.5 μL，灭菌蒸馏水14.7 μL，约10 ng DNA。PCR反应液配制完后，轻轻震荡混匀，将PCR管放入PCR仪中，进行如下反应：预变性温度95 ℃，时间5 min，变性温度95 ℃，时间30 s，退火温度52 ℃，时间30 s，复性温度72 ℃，时间为1 min 40 s， 35个循环后72 ℃延伸7 min，获得扩增产物。取3 μL扩增产物，采用1%的琼脂糖凝胶，在电压100～150 V下电泳15 min，凝胶成像系统下观察并拍照。

利用鉴别引物进行位点特异性PCR反应，并分别考察退火温度、PCR循环数、引物浓度、dNTP用量对PCR反应稳定性的影响。

2.3 双向位点特异性PCR 反应条件的确定 为获得最优的PCR反应条件，本文首先建立了特异性PCR方法，具体方法为：反应体系总体积为20 μL，包括10×buffer缓冲液2 μL， dNTP1.6 μL，引物各0.25 μL（5 pmol·L-1）， EX Taq 酶0.2 μL （5 U·μL-1），DNA 0.5 μL，灭菌蒸馏水14.7 μL。反应条件：预变性温度95 ℃，时间5 min，变性温度95 ℃，时间30 s，退火温度52℃，时间30 s，复性温度72 ℃，时间为1 min 40 s， 延伸温度72 ℃，时间为7 min， 循环次数为35个，最后4 ℃保存。并对其反应条件进行优化。

2.4 位点特异性PCR鉴别黄芪及红芪 取黄芪及红芪不同样品DNA进行双向位点特异PCR反应，反应体系为10×buffer缓冲液2 μL， dNTP1.6 μL，AM-F， AM-R各0.3 μL （5 pmol·L-1）， HP-F， HP-R各0.2 μL， EX Taq 酶0.2 μL （5 U·μL-1），DNA 0.5 μL，灭菌蒸馏水14.7 μL。PCR反应程序见表2.反应结束后在PCR体系中加入5 μL 6×loading buffer，混匀后于EB染色的1.5%浓度琼脂糖凝胶电泳检测，SYNGENE凝胶成像系统观察、成像。

配置不同黄芪与红芪比例的混合样品，其中加入的红芪占总量的1%，5%，10%，20%，40%，60%，80%。分别提取DNA，进行PCR，反应体系及反应程序同上。

3 结果及讨论

3.1 鉴别引物设计及验证 选择通用引物 trn L-trn F对黄芪和红芪样品进行PCR扩增，然后通过Clastul W软件进行序列比对，根据其变异区设计2对特异引物。利用位点特异性PCR方法对特异引物进行验证，PCR结果发现通过利用黄芪位点特异PCR引物对黄芪和红芪进行扩增，黄芪可以扩增出1条带，而红芪则扩增不出条带。使用红芪位点特异PCR引物，红芪可以扩增出1条带，而黄芪则扩增不出条带。结果表明设计的特异引物可以用作黄芪和红芪的鉴别引物。

3.2 双向位点特异性PCR 反应条件的优化 通过考察退火温度、PCR循环数、引物浓度、dNTP用量4个因素，根据优化结果可以看出，退火温度为52 ℃时，两条特异条带扩增结果更明显。当PCR循环数为32个时，仍然可以检测出扩增的条带，相比优化前的35个反应循环数，缩短了鉴别的时间。当上述反应体系中加入dNTP的量为原来加入量的1/2时，即加入的dNTP的量为0.8 μL， 加入的黄芪引物AM-F/AM-R为原来加入量的1.2倍时，即加入的引物为0.3 μL， 加入的红芪引物HP-F/HP-R为原来加入量的0.8倍时，即加入的引物为0.2 μL时， 双向位点特异性PCR效率更优。综上表明，引物和dNTP用量对特异性PCR影响较大，且黄芪与红芪特异性PCR的反应条件中引物和dNTP的使用量均不宜太高，见表3。

表3 PCR条件优化

Table 3 Optimization of PCR amplification

注：AM1.蒙古黄芪（内蒙古土右）；AM2. 蒙古黄芪（内蒙古固阳）；AM3. 蒙古黄芪（内蒙古赤峰）；AM4. 膜荚黄芪（山西浑源）；AM5. 膜荚黄芪（甘肃陇西）；AM6. 膜荚黄芪（内蒙古赤峰）；HP1.红芪（甘肃武都）；HP2.红芪（甘肃宕昌）；HP3.红芪（内蒙古土右旗）；+.亮带；.暗带。

3.3 位点特异性PCR鉴别黄芪和红芪 使用通用引物 trn L-trn F可以将所有黄芪和红芪样品扩增出大约1 000 bp的条带；使用黄芪位点特异性PCR引物，只有黄芪可以扩增出136 bp条带，而红芪不能够扩增出条带；使用红芪位点特异性PCR引物，只有红芪可以扩增出323 bp条带，而黄芪不能够扩增出条带，见图2。而对于不同比例黄芪与红芪的混合样品，采用双向位点特异PCR方法检测结果表明，当黄芪中掺入的红芪为1%，5%时，不能扩增出红芪的特异条带，当掺入的红芪占总量的10%，20%，40%，60%，80%时，都可以检测到红芪的特异条带，见图3，即通过本实验方法可以检测出来黄芪中掺入10%以上的红芪。

A.通用引物 trn L-trn F；B.黄芪鉴别引物；C.红芪鉴别引物；M.DNA相对分子质量标准：从上至下依次为2 000，1 000，750，500，250，100 bp；1.蒙古黄芪（内蒙古土右）；2. 蒙古黄芪（内蒙古固阳）；3. 蒙古黄芪（内蒙古赤峰）；4. 蒙古黄芪（内蒙古达茂旗）；5. 膜荚黄芪（山西浑源）；6. 膜荚黄芪（甘肃陇西）；7. 膜荚黄芪（内蒙古赤峰）；8. 膜荚黄芪（安徽亳州）；9.红芪（甘肃武都）；10.红芪（甘肃宕昌）；11.红芪（内蒙古土右旗）；12. 阴性对照。

图2 位点特异性PCR鉴别黄芪及红芪凝胶电泳

Fig.2 Agarose gel electrophoresis of specific PCR amplification products amplified from Astragali Radix and Hedysari Radix

M.DNA相对分子质量标准：从上至下依次为2 000，1 000，750，500，250，100 bp；1～7.黄芪中掺入1%，5%，10%，20%，40%，60%，80%的红芪；8. 阴性对照。

图3 不同比例黄芪-红芪双向位点特异性PCR凝胶电泳图

Fig.3 Agarose gel electrophoresis of specific PCR amplification products amplified from different percentage mixture of Astragali Radix and Hedysari Radix

4 小结

本文利用稳定性强、重复性好、操作过程简单的位点特异性PCR方法可成功解决黄芪与红芪药材的鉴别问题。位点特异性PCR方法具有易于检测且快速的特点，相比一些需要测序的分子鉴定方法而言，该方法对于黄芪与红芪药材之间的鉴别显示出较大的优势。同时本文利用双向位点特异PCR方法可以检测出黄芪中掺入10%以上红芪的混杂品，这使得黄芪与红芪间的鉴别工作又向前推进了一步。因此，作为传统鉴别方法的补充，位点特异性PCR方法对鉴定黄芪与红芪有一定的参考价值，相信将成为今后有关黄芪与红芪及其混合品鉴定的有效手段，对大宗药材黄芪的正本清源有重要的指导意义。同时对于保障人民用药安全意义重大。

[致谢] 道地中药功能基因组研究北京市重点实验室提供的技术支持。

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Study on identification of Astragali Radix and Hedysari Radix by

PCR amplification of specific alleles

LONG Ping， CUI Zhan-hu， LI Qian-quan， Xu Jian-ping， ZHANG Chun-hong， ZHOU Li-she*， LI Min-hui*

（Baotou Medical College， Inner Mongolia， Baotou 014060， China）

[Abstract] To explore the new method of discriminating Astragali Radix and Hedysari Radix by using PCR amplification of specific alleles， 30 samples of the different Astragali Radix materials and 28 samples of Hedysari Radix were collected. The total DNA of all samples were extracted， trn L-trn F sequence from Astragali Radix and Hedysari Radix was amplified by PCR and sequenced unidirectionally. These sequences were aligned by using Clustul W. Primer was designed and the PCR reaction systems including annealing temperature， dNTP， etc were optimized. All samples were amplified by PCR with specific primer， DNA from Astragali Radix would be amplified 136 bp， whereas PCR products from all of Hedysari Radix were 323 bp. This method can detect 10% of intentional Hedysari Radix DNA into Astragali Radix. PCR amplification of alleles can be used to identify Astragali Radix and Hedysari Radix successfully and is an efficient molecular marker for authentication of Astragali Radix and Hedysari Radix.

[Key words] Astragali Radix； PCR amplification of specific alleles； molecular identification

doi：10.4268/cjcmm20131607