藏药材“白花刺参”抑制NO生成作用的谱效相关分析

摘要 目的：研究白花刺参HPLC-ELSD的化学指纹与抗一氧化氮（NO）生成作用的相关性，为确定抗炎活性成分推荐质量控制指标提供依据。方法：色谱柱为Eclipse XDB C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流动相为水-乙腈，梯度洗脱，体积流量为1 mL·min-1；柱温 35 ℃；ELSD漂移管温度为104 ℃；N2气体流速为2.8 L·min-1；进样量10 μL。测定10 批白花刺参的HPLC-ELSD指纹图谱和对脂多糖诱导巨噬细胞生成NO的抑制作用，采用相似度分析和偏最小二乘法对HPLC-ELSD指纹图谱与抗NO生成作用进行相关分析。结果：在10 批药材色谱指纹图谱中，相似度均在0.90 以上，确定15个共有峰，其中7个色谱峰与抗炎活性呈显着正相关，可被选作质量控制指标。结论：该指纹图谱检测方法方便，重复性好，可用于白花刺参药材质量控制和抗炎活性评价的实验依据。

关键词 白花刺参；HPLC-ELSD；指纹图谱；相关分析；抗炎活性

收稿日期 2012-12-28

基金项目 国家科技支撑计划项目（2012BAI27B07）；澳门特别行政区科学技术发展基金项目（073/2011/A3）

通信作者 *张志锋，E-mail： 白花刺参是川续断科刺续断属植物白花刺参Morina nepalensis D. Don var. alba （Hand.-Mazz.） Y. C. Tang 的干燥全草，为常用藏药之一，在藏医药典籍《四部医典》、《蓝琉本草》和《宇妥本草》等中均有记载，藏药名为“将刺嘎保”。同时，白花刺参亦是中华人民共和国卫生部药品标准《藏药标准》中刺参的资源植物之一，其性味甘、涩，温；有催吐，健胃功效。主要用于关节痛、小便失禁、腰痛、眩晕及口眼歪斜等；可外用治疖疮、化脓性创伤、肿瘤等[1]。目前对于白花刺参的现代化学及药理活性研究较少，文献报道白花刺参中含有咖啡酰基奎宁酸、三萜皂苷等成分[2-5]。本实验拟采用HPLC-ELSD对白花刺参进行指纹图谱研究，同时利用体外一氧化氮（NO）生成抑制作用实验评价白花刺参抗炎活性，采用偏最小二乘法（partial least squares method，PLS）分析白花刺参指纹图谱与抗炎作用的谱效相关性，为建立白花刺参质量标准提供科学依据。

1 材料

Agilent 1200高效液相色谱仪；ELSD检测器（美国）；Eclipse XDB C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；Millipore Milli-Q 超纯水机（美国）；METTLER AE240 电子分析天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；W201B恒温水浴锅（上海申顺生物科技有限公司）。乙腈为色谱纯（美国fisher公司），其余所用试剂均为分析纯。

白花刺参采自四川省甘孜藏族自治州、云南迪庆藏族自治州和阿坝藏、羌族自治州，由四川大学华西药学院张浩教授鉴定，见表1。将药材45 ℃干燥后粉碎，过40目筛，备用。刺参苷J对照品（本实验室自制，经波谱学鉴定和色谱法检测其质量分数在纯度>98 %）。

RAW264.7 （鼠性巨噬细胞株）购自美国ATCC，本实验室冻存。培养液Gibco DMEM， FBS购自Invitrogen公司，氨基胍，脂多糖（Lipopolysaccharide， LPS），购自Sigma 公司（St. Louis，MO， USA），其他试剂均为国产分析纯。全自动酶标仪WellscanMK-2 （Labsystems公司），CO2恒温培养箱（ThermoFisher Scientific公司），BD 96 孔培养板、培养皿等。

2 方法

2.1 色谱条件

色谱柱为Eclipse XDB柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流动相为乙腈（B）-水（A），梯度洗脱（0 ～5 min 75%A，5～15 min 75%～70%A，15～26 min 70%～67%A，26～28 min 67%～61%A，28～45 min 61%～55%A）；体积流量为1 mL·min-1；柱温为30 ℃；漂移管温度为104 ℃；N2气体流速为2.8 L·min-1；进样量为10 μL，样品采集时间为45 min。

表1 药材来源

Table 1 The spot of sample collection

2.2 对照品溶液的制备

精密称取刺参苷J对照品适量，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释制成每1 mL含刺参苷J 0.285 mg的对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

取白花刺参粉末（过4号筛）约1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加甲醇25 mL，密塞，称重，超声（45 kHz，300 W）处理40 min，冷却，再称重，用甲醇补足失重，摇匀，0.45 μm 微孔滤膜过滤，取续滤液，即得供试品溶液。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度试验 取同一批白花刺参供试品溶液，按2.1项下色谱条件连续进样5 次，记录色谱图，结果各共有峰与参比峰的相对保留时间与相对峰面积的RSD分别为0.02%～0.24%与0.92%～2.9%，结果表明仪器精密度较好。

2.4.2 稳定性试验 取同一批白花刺参药材供试品溶液，按2.1项下色谱条件于0，2，6，12，24 h进样，记录色谱图，结果各共有峰与参比峰的相对保留时间与相对峰面积的RSD分别为0.08%～0.34%与0.53%～2.8%，表明供试品溶液在24 h内基本稳定。

2.4.3 重复性试验 取同一批白花刺参药材5 份，同法制成供试品溶液，按2.1项下色谱条件分别检测，记录色谱图，结果表明，各共有峰与参照峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD分别为0.12%～0.30%与0.28%～2.5%，说明本方法的重复性良好。

2.5 样品测定

分别吸取白花刺参药材供试品溶液与对照品溶液10 μL，注入HPLC仪，按2.1项下色谱条件进行测定。

2.6 白花刺参提取物抗NO生成的作用

细胞内生成的一氧化氮很快被氧化成NO2-，通过NO2-可间接测定一氧化氮的生成量。RAW264.7 巨噬细胞，细胞浓度1×106个/mL，种入97孔细胞培养板，在含10%牛血清的Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）培养。加入1 mg·L-1 LPS10 μL，4 h后再分别加入提取物（200 mg·L-1）供培养12 h。上清液100 μL与等体积的Griess 试剂 （10 g·L-1对氨基苯磺酸、1 g·L-1的萘乙烯二胺和20 g·L-1磷酸溶液）混合，室温下反应10 min 以上，于570 nm下进行比色测定。以NO2-的量表示NO的含量，并以NaNO2为对照品绘制标准曲线，将样品吸光度A以内插法换算成样品NO2-浓度[6]。

3 结果与分析

3.1 指纹图谱的建立及共有峰的确定

分别制备已收集的10批白花刺参供试品溶液，按以上色谱条件测定，记录色谱图。参照峰的选择直接影响到标准指纹图谱参数和相似度评价的可靠性，因此本文按照以下条件选择参照峰：主要有效成分之一；每批样品中都含有这种成分；保留时间的RSD≤1%；单峰面积占总峰面积10%以上。根据10 个产地的化学指纹图谱的检测结果，生成白花刺参药材共有模式的对照指纹图谱，8号峰（刺参苷J）符合以上4个条件，因而作为参照峰（s） 。理论塔板数以刺参皂苷J峰计算不低于40 000。分析色谱图可以确定白花刺参指纹图谱中的15 个色谱峰为共有特征峰，见图1。

3.2 共有指纹峰的相对时间和相对峰面积

在供试品色谱图中，以8号峰刺参苷J为参照峰（s），将其保留时间和色谱峰面积定为1，将其他共有特征峰的保留时间与峰面积和刺参苷J的保留时间与峰面积相比，得到各峰的相对保留时间和相对峰面积。按以上方法计算10批不同来源白花刺参药材的15 个共有指纹峰的相对保留时间和相对峰面积，显示出了很好的“共有”特点。

3.3 指纹图谱相似度评价

本研究采用“中药色谱指纹图谱相似度评

图1 10批白花刺参药材的指纹叠加图（A） 和药材代表性的HPLC-ELSD指纹图谱（B）

Fig.1 HPLC-ELSD fingerprint of representative whole herbs of Morina nepalensis （A） and overlap fingerprint of 10 batches of whole herbs of M. nepalensis （B） from different habitats

价系统（2004A版）”对各样品色谱图的原始数据文件进行分析，并以 10批样品生成的对照谱图作为对照模板，计算各色谱图的整体相似度。结果表明其相似度存在一定的差异，但都在0.9以上。

3.4 白花刺参提取物抑制NO生成的作用

本研究测定了10批白花刺参提取物对LPS诱导的RAW264.7细胞生成NO的抑制作用，结果表明LPS显着增加巨噬细胞体外生成NO （P

3.5 白花刺参HPLC-ELSD指纹图谱与抗炎作用的相关性分析

采用PLS法对10批白花刺参提取物样本与对应的抑制NO生成作用进行相关分析，通过各色谱峰的标准化回归系数的大小与正负分析指纹图谱色谱峰与抑制NO生成作用的相互关系。通过PLS的回归分析，HPLC-ELSD指纹图谱中的15个色谱峰的标准化回归系数分别为0.187，0.321，0.283，0.307，0.306，0.349，-0.008，0.109，0.228，-0.519，0.139，0.372，-0.300，0.254，0.039。指纹图谱中，1～6，8，9，11，12，14，15号色谱峰与抑制NO活性呈正相关，即这12个色谱峰强度如果增加，抑制NO

表2 10批样品提取物对LPS诱导的RAW264.7细胞生成NO的影响

Table 2 Effects of 10 batches extracts on NO production by LPS-induced RAW264.7 cell

注： LPS组相比1）P

生成作用将增强，其IC50将降低。这些峰的PLS回归系数越大，说明对抑制NO生成作用的贡献越强。在所得的结果中可以看出，2，4～6，10，12，13是回归系数较大的7个色谱峰，因而，这7个化合物可能在抑制NO生成活性中起主要作用。

4 讨论

本研究考察了甲醇-水、甲醇-0.2%三乙胺水溶液、乙腈-水、乙腈-0.2%三乙胺水溶液等4种流动相系统，进行二元梯度洗脱，结果表明，甲醇-水系统中色谱峰分离较差，乙腈-水系统的分离效果较好，故选择乙腈-水作为流动相进行二元梯度洗脱。同时，也对ELSD的检测条件进行了优化，包括载气流速、漂移管温度等。

通过对各批药材的指纹图谱测定结果的分析，并通过指纹图谱相似度软件分析，发现其相似度较高，均在0.90以上，说明不同采集地的10批白花刺参药材化学成分的种类和含量之间具有较高的相似性。由此说明尽管白花刺参在我国青藏高原的分布较广，其基本的化学组成是基本一致的。然而不同产地的种源可能受地域、土壤环境等影响，在化学组成以及药效上又具有一定的差异性，这对白花刺参规范种植基地规划具有一定的参考价值，同时对藏区合理使用白花刺参药材提供理论基础。

本研究采用偏最小二乘法对白花刺参化学组成与抑制NO生成作用进行了相关分析，既可以得到白花刺参提取物对抑制NO生成作用起主要作用的色谱峰， 又可以获得各色谱峰之间相互作用的信息， 为研究药物组分间的相互关系提供可能，同时为中药及民族药物药效物质快速筛选及谱效关系的研究提供了参考。

[参考文献]

[1] 中华人民共和国卫生部药典委员会.中华人民共和国卫生部药品标准·藏药标准.第1册[S].1995：56.

[2] 滕荣伟，谢鸿妍，李海舟，等. 白花刺参中两个新三萜皂苷[J]. 有机化学， 2002， 22（8）：560.

[3] Teng R W，Zheng Q A，Wand D Z. Two New Saponins from Morina nepalensis var. [J]. Acta Bot Sin，2003， 45（1）：122.

[4] Teng R W， Xie H Y， Wang D Z. Four new ursane-type saponins from Morina nepalensis var. alba[J]. Magn Reson Chem， 2002， 40：603.

[5] 滕荣伟， 周志宏， 王德祖， 等. 白花刺参中的咖啡酰基奎宁酸成分[J]. 波谱学杂志， 2002， 19（2）：167.

[6] Green L C， Wagner D A， Glogowski J， et al. Analysis of nitrate， nitrite， and [15N]nitrate in biological fluids[J]. Anal Biochem， 1982， 126（1）：131.

Spectrum-effect correlation analysis of traditional Tibetan medicine

″Morina nepalensis″ on nitric oxide production inhibition

LUO Pei， LIU Yuan， LV Lu-yang， ZHANG Zhi-feng（1.State Key Laboratory for Quality Research of Chinese Medicines， Macau University of Science and Technology， Macau， China；

2.Ethnic Pharmaceutical Institute， Southwest University for Nationalities， Chengdu 610041， China）

[Abstract] Objective： To establish an HPLC-ELSD fingerprint of the whole herbs of Morina nepalensis and perform the correlation analysis of chemical components of the herb and nitric oxide （NO） production inhibition. Method： HPLC-ELSD assay was performed to evaluate 10 batches of M. nepalensis herbs. The chromatographic conditions were as following： Eclipse XDB C18 column（4.6 mm×150 mm，5 μm）， water （A） and acetonitrile （B） as a gradient mobile phases， flow rate 1.0 mL·min-1， and column temperature at 35 ℃. Evaporative light-detection conditions： atomization temperature at 104 ℃， the flow rate of N2 2.8 L·min-1 and 10 μL sample injection. Chromatographic fingerprint was developed， and the inhibition activity of production of NO in lipopolysaccharide-induced macrophages was also analyzed. The similarity and correlation analysis between the HPLC-ELSD fingerprints and NO production inhibition were carried out by PLS method. Result： The common mode for M. nepalensis herb fingerprint was established，including 15 common characteristic peaks. Among them，7 peaks were positively correlated with the NO production inhibition. According to the assessment on the similarity of 10 batches of samples， a similarity of over 0.90 were shown in HPLC-ELSD fingerprint and all samples were separated into two groups. Conclusion： This method can be used to assess the quality of M. nepalensis， which provides a reliable method for scientific assessment and quality control.

[Key words] Morina nepalensis； HPLC-ELSD； chromatographic fingerprint； similarity analysis； anti-inflammation

doi：10.4268/cjcmm20131727