基于胸腺嘧啶三聚氰胺胸腺嘧啶结构和SYBR Green Ⅰ荧光检测牛奶中三聚氰胺

摘要基于胸腺嘧啶（T）三聚氰胺T特异性结构，建立了SYBR Green Ⅰ荧光均相检测三聚氰胺的方法。三聚氰胺不存在时，SYBR Green Ⅰ与聚T单链DNA结合较弱，荧光信号较弱；三聚氰胺存在时，聚T单链DNA通过T三聚氰胺T错配形成折叠结构。SYBR Green Ⅰ嵌入双链DNA的双螺旋结构中，释放出强荧光信号。结果表明，三聚氰胺浓度在0.1～10 μmol/L范围内呈良好的线性关系，检出限为

1引言

三聚氰胺是一种三嗪类含氮杂环有机化合物，其含氮量高，约为66.6%＼[1＼]，远高于蛋白质（平均含氮量16%）。现用检测食品中蛋白质含量的方法为凯氏定氮法，它通过检测食品中的含氮量确定蛋白质的含量。因此，食品或饲料中添加三聚氰胺，会使蛋白质含量虚高。同时，三聚氰胺作为一种白色结晶粉末，无味，掺杂后不易被发现，从而使劣质食品和饲料在检测时蒙混过关。三聚氰胺与尿酸结合生成难溶于水的结石＼[2＼]，对人体健康构成威胁，甚至可能引起婴幼儿死亡。因此，准确测定食品及饲料中的三聚氰胺含量具有重要意义。

传统的检测三聚氰胺的方法有气相色谱质谱联用法＼[3＼]、酶联免疫检测法＼[4＼]、高效液相色谱法＼[5＼]等。但是这些方法操作复杂， 需要高素质的操作人员或者分析时间较长，不能满足日常快速分析的要求。近年发展了一些检测三聚氰胺的新方法，如电化学方法＼[6＼]、化学发光法＼[7＼]、纳米材料比色法＼[8，9＼]、荧光探针法＼[10，11＼]和表面增强拉曼散射技术＼[12＼]。尽管这些方法检出限低、灵敏度高，但是预处理复杂耗时，需要衍生过程或者昂贵的仪器。

最近研究发现，三聚氰胺可以通过分子间氢键介导胸腺嘧啶（T）配对，形成稳定的T三聚氰胺T特异性结构＼[13～15＼]。Huang研究小组＼[13＼]利用此原理实现了对三聚氰胺的比色检测。聚T链在纳米金表面吸附后，在一定盐离子存在下，通过T三聚氰胺T特异性作用，纳米金颗粒团聚，宏观上发生由红色到蓝色的颜色变化。尽管上述方法提高了三聚氰胺检测的灵敏度，且具有较好的特异性，但需要合成纳米金，操作复杂，成本高。SYBR Green Ⅰ（SG）是一种双链DNA荧光染料。与单链DNA单独存在时显示非常弱的荧光，与双链DNA结合后，荧光信号大大增强＼[16，17＼]。

本研究利用T与三聚氰胺的特异性结合，设计了一种均相检测三聚氰胺的荧光传感方法。三聚氰胺的存在促使聚T单链DNA改变其构象，形成折叠结构，SYBR Green Ⅰ（SG）与双链DNA结合产生强的荧光信号。本方法简单，快速，成本低，灵敏度高， 可用于食品中三聚氰胺的现场快速检测。

2实验部分

2.1仪器与试剂

Hitachi F7000荧光分光光度计（日本Hitachi公司）， 激发波长480 nm，扫描范围505～580 nm，激发和发射狭缝宽度均设为5.0 nm。

三聚氰胺（上海百灵威科技有限公司）；SYBR Green Ⅰ （SG， 10000×，北京鼎国生物技术有限公司）；DNA链（由大连宝生物有限公司合成）；其它试剂均为分析纯；实验用水为超纯水（电阻大于18.3 MΩ）。

2.2三聚氰胺的检测

在25 μL反应体系中包含10 mmol/L 磷酸盐缓冲液（PBS， pH 7.4，200 mmol/L NaCl）、30 nmol/L聚T核酸链，2×SG； 加入系列浓度的三聚氰胺，混合均匀后，室温下避光培育30 min后，稀释到100 μL， 放入荧光光谱仪， 检测荧光信号强度。

3结果与讨论

3.1实验原理

基于三聚氰胺特异性DNA和SG Ⅰ荧光定量检测三聚氰胺的原理如图1所示。三聚氰胺不存在时，聚T链为柔性的单链结构，荧光信号很弱。因为SG Ⅰ是一种双链核酸染料，与单链DNA的结合较弱，游离状态下的SYBR Green Ⅰ只能发出微弱的荧光。当三聚氰胺存在时，三聚氰胺能够与胸腺嘧啶（T）通过分子间氢键形成T三聚氰胺T的特异性结构（图1B），使聚T链发生折叠。SG Ⅰ嵌入双链DNA的双螺旋结构中，在528 nm处释放出强的荧光信号（图1A）。利用检测体系在该波长处荧光强度的变化，实现对三聚氰胺的定量检测。

[TS（]图1（A）基于胸腺嘧啶（T）三聚氰胺T特异性结构和SG Ⅰ荧光检测三聚氰胺的原理图图2是三聚氰胺存在与否的荧光发射光谱图。当只有SG存在时，溶液的荧光信号很弱（曲线a）。SG与聚T链共存，但三聚氰胺不存在时，SG通过静电作用与单链DNA发生微弱的结合，发出比SG单独存在下稍强的荧光信号（曲线b）。当加入10 μmol/L三聚氰胺后，产生了强的荧光信号，约为SG与聚T链混合溶液的10倍（曲线c）。说明聚T链与目标三聚氰胺结合形成了T三聚氰胺T配合物，促使单链DNA探针形成了稳定的折叠结构，SG与双链DNA结合，荧光强度大大增强。同时，为了证明T与三聚氰胺的特异性作用，即传感器对三聚氰胺的检测要求探针是特异性的，选用一条富含G序列的非特异性探针（链的序列为：5′GGGTAGGGCGGGTTGGG3′），加入三聚氰胺，其它条件不变，进行了考察，结果见图2d，荧光强度并未显著增大。说明三聚氰胺未与非特异性探针相互作用，不能形成折叠结构，单链DNA不被SG染色，荧光信号很弱。

3.3实验条件优化

DNA链长度对荧光响应信号有重要影响。本实验选用两种长度的DNA链（T24和T55）进行比较，结果如图3A所示。T24链与T55链的响应荧光信号强度相当，但是长T55链的空白荧光信号值较高，降低了信噪比。所以，本实验中采用的寡核苷酸链为T24。

SG浓度也是一个重要参数。SG浓度越大，荧光信号的增强越明显，但是SG浓度过高，也会产生较高的背景。从图3B可见（F和F0分别代表检测体系中三聚氰胺存在与否的荧光强度），随着SG浓度的增加， F/F0逐渐增加，于2×SG浓度处达到最大。故选取2×SG浓度作为最佳染料用量。

在反应体系中，SG能与单链DNA发生微弱结合，产生较低的荧光强度。与双链相比，虽然这种信号非常小，但是当溶液中单链DNA的浓度较大时，这种影响也不可忽略。由图3C可见，当T24链的浓度为30 nmol/L时，F/F0值最大。因此，本实验中DNA的浓度选择为30 nmol/L。

三聚氰胺与T错配杂交形成了折叠结构，继而SG嵌入双链DNA的双螺旋结构中，释放出较强的荧光信号。因此，反应时间的长短对于SG荧光定量有重要影响。从图3D可知，当反应时间为30 min时实验获得了最佳的信倍比。故最优反应时间选择30 min。

3.4传感器的分析性能

在优化的实验条件下，对系列不同浓度的三聚氰胺进行了检测，结果见图4A，荧光强度随着三聚氰胺浓度在0.1～10 μmol/L范围内迅速增加。插图为528 nm处荧光强度与三聚氰胺浓度的校正曲线图。由图4A可知，荧光强度与三聚氰胺浓度在0.1～10 μmol/L范围内呈良好的线性关系， 用空白的3倍标准偏差原则确定检出限为35 nmol/L，低于国际规定食品中三聚氰胺的含量，所以本方法适用于食品中三聚氰胺的检测。

为了证明此传感器的选择性，选用一些与三聚氰胺具有相似结构的物质进行了考察，如邻苯胺、对苯胺、胞嘧啶和胸腺嘧啶。从图4B可见，所考察的干扰物质荧光强度都未得到明显增强。说明此传感器对三聚氰胺的检测具有较高的选择性。

4结论

构建了一种基于胸腺嘧啶三聚氰胺胸腺嘧啶特异性结构的光学传感器用于三聚氰胺的检测。三聚氰胺的存在使聚T链形成T三聚氰胺T结构发生折叠，导致荧光强度增强，据此实现对目标物的检测。本方法具有所用试剂简单，不需要任何标记，成本低；操作简单，整个分析过程仅需30 min，分析周期短； 无需依赖大型仪器； 灵敏度高的特点。初步实现了牛奶中三聚氰胺的加标回收检测。本研究建立的非标记的荧光传感器，可满足大多数检测的需要，有望在乳制品、奶粉、原料乳等检测中得到广泛应用。

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AbstractA novel fluorescence homogeneous biosensing strategy was developed for simple， rapid and sensitive detection of melamine in milk by using the polythymine oligonucleotide T24 and SYBR Green Ⅰ. In the absence of melamine， the fluorescence of SYBR Green Ⅰ was weak. The interactions between the single strand oligonucleotide T24 and SYBR Green Ⅰ were weak. In contrast， the presence of melamine drove the formation of TmelamineT folded structure and enabled the SYBR Green Ⅰ to intercalate into doublestrand DNA， resulting in the enhancement of fluorescence intensity. The results revealed that the method allowed a sensitive， simple， and rapid assay of melamine with a linear response range from 0.1 μmol/L to 10 μmol/L and a detection limit of 35 nmol/L.

KeywordsTmelamineT； SYBR Green Ⅰ； Fluorimetry； Melamine

（Received 28 February 2014； accepted 3 April 2014）

This work was supported by the Natioal Natural Science Foundation of China （Nos. 21205035）， Hunan Province （Nos. 12JJ4017， 13JJ3123） and the Construct Program of the Key Discipline in Hunan Province.