抗痨胶囊剂体内外抗肺结核作用研究

【摘要】 目的 体内外评价抗痨胶囊防治肺结核作用。方法 运用试管法观察两种制剂体外对结核菌生长的影响,运用结核豚鼠观察药物体内对结核病的防治作用。结果 抗痨胶囊体外对人型H37RV结核杆菌、牛型分枝杆菌及耐异烟肼、耐利福平、耐链霉素和联合耐异烟肼、利福平及链霉素结核杆菌的MIC和MBC分别为0.5 mg/ml和5 mg/ml、10 mg/ml和大于20 mg/ml、5 mg/ml和10 mg/ml、5 mg/ml和10 mg/ml、10 mg/ml和20 mg/ml。体内抗结核实验结果显示:抗痨胶囊可显著减少结核豚鼠肺脏的结核结节及肺脏和脾脏的结核菌数量,同时还可减轻结核豚鼠肝脏、脾脏及肺脏的炎性反应。并可显著减少豚鼠脾脏的结核结节。结论 上述结果显示,抗痨胶囊对肺结核有一定的防治作用,有一定的开发前景。

【关键词】抗痨胶囊;肺结核;药理研究

Research of effects on anti-pulmonary tuberculosis of anti tuberculosis capsule in vitro and in vivo

LI Gang.Department of pharmacy,Dazhou county people’s hospital of Sichuan Province; Dazhou county people’s hospital of Sichuan Province,635000

【Abstract】 Objective To estimate effects on anti-pulmonary tubenrculosis of anti tuberculosis capsule in vitro and in vivo.Methods Observe the growing effects of the two pharmaceutics on tubercle bacillus by test tube method in vitro,and the preventive and therapeutic effects of the drugs on guinea pigs’ modles in vivo.Results MIC and MBC of anti tuberculosis capsule onH37RV tubercle bacillus,mycobacterium bovis,tubercle bacillus resistance to isoniazid,rifampicin,streptomycin,and tubercle bacillus combine resistance to isoniazid,rifampicin,streptomycin are 0.5 mg/ml and 5 mg/ml、10 mg/ml and>20 mg/ml、5 mg/mland 10 mg/ml、5 mg/ml and 10 mg/ml、10 mg/ml and 20 mg/ml in vitro.In vivo test results showed thatanti tuberculosis capsule could decrease significantly the tubercular nodule of lung and the amount of tubercle bacillus in the lung and splenic of guinea pigs,and alleviate inflammatory reaction in liver,spleen and lung of guinea pig,and decrease significantly the tubercular nodule of spleen.Conclusion The above results showed that anti tuberculosis capsule has some preventive and therapeutic effects on pulmonary tubereulosis,and has some exploitation perspective.

【Key words】Anti tuberculosis capsule; Pulmonary tubereulosis; Pharmacology research

作者单位:635000四川省达州市达县人民医院药剂科

肺结核(pulmonary tubereulosis)是由结核杆菌引起的慢性肺部感染,常在机体抵抗力降低和细胞介导的变态反应性增高时发病。目前全球已有1/3人口约17亿人感染结核病,现有结核患者2000万。每年发生新患者约800万,每年死于结核病者约300万人。我国三次肺结核流行病学抽样调查表明,活动性肺结核患病率:1979年为717/10万,1984年为550/10万,1990年为523/10万[1]。近年来,由于耐药菌株的增加,许多以前能有效防治结核的西药的疗效受到了很大的限制,肺结核已经成为一种引起国际上高度重视的传染病。中医认为本病归属“肺痨”范畴,是由于痨虫侵蚀肺叶引起的一种具有传染性的慢性衰弱性疾病。在治疗上多采取扶正驱邪的方法,收到了较好的疗效。抗痨胶囊由百部、黄芪等数味中药组成,该方在临床用于肺结核的辅助治疗中取得了较好效果,本文拟报告该药的部分实验研究结果如下。

1 材料和方法

1.1 试验药品 抗痨胶囊剂:1 g浸膏相当于6.42 g原生药,由四川省中药研究所药化室提供。临用前用蒸馏水配成所需浓度的混悬液备用,本实验剂量按g原生药/kg计算。

利福平(RPP)胶囊:0.15 g×100粒,成都锦华药业有限公司出品,批号为080912,有效期至2010-08,临用前用0.5%CMC配成所需浓度的混悬液备用。

1.2 试验菌株 H37RV标准菌(ATCC27294):牛型分支杆菌;单耐RFP菌;单耐INH菌;单耐SM菌;耐INH+SM+RFP菌;均由中国疾病预防控制中心结核病预防控制分中心提供。

2 实验动物

豚鼠:一级动物;雌雄各半,体重:300~320 g。生产许可证号:15号,由四川省实验动物研究所提供。

3 实验环境

四川省中药研究所药理实验室,清洁级动物使用环境,合格号为:医动字第24103117号。

4 方法与结果

4.1 对细菌生长的影响

4.1.1 体外对结核菌生长的影响 最小抑菌浓度(MIC)的测定[2,3]:采用试管法,将药物分别加入苏通培养基内后,加入定时的菌液(1 mg/ml,每支接种0.1 ml),经37℃培养2周后,每支吸0.1 ml转种于2支改良罗氏(L-J)培养基斜面同时设空白对照管。在含药苏通培养基内培养2周见细菌生长的最小浓度为最小抑菌浓度。

最小杀菌浓度(MBC)的测定:将在苏通培养基内未见细菌生长的培养物,分别吸取0.05 ml接种于改良罗氏(L-J)斜面,经37℃培养4周后,所接种的2支培养基斜面上的菌落数之和少于5个的最小稀释度的药物浓度为该药的最小杀菌浓度。

表1

体外对结核菌生长的影响

菌株

抗痨胶囊利福平

MIC(mg/ml)MBC(mg/ml)MIC(mg/ml)MBC(mg/ml)

人型H37RV0.5550250

牛型分枝杆菌104050250

耐INH51050250

耐RFP51050250

耐SM51050250

耐INH+SM+RFP104050250

从表1可见,抗痨胶囊对牛型结核菌、耐INH菌、耐RFP菌、耐SM菌及耐INH+RFP+SM的结核菌均有一定的抑制或杀灭作用。

4.1.2 体内对结核感染豚鼠的作用 豚鼠经PPD测试阴性后,随机分组,分别灌胃抗痨胶囊20 g/kg、10 g/kg、5 g/kg;利福平50 mg/kg及等量蒸馏水,1次/d,连续45D。在给药后2周,除对照组外,在各豚鼠蹊部皮下注射菌悬液0.5 ml/只(将1 mg/ml的菌悬液稀释100倍)使动物感染结核杆菌。在末次给药后24 h处死动物,解剖肉眼计数每个脏器的结核结节,取肺脏、肝脏及脾脏称湿重并计算其脏器指数,然后称取一定量的组织做匀浆以便做结核菌培养,同时将各组织置于10%福尔马林中固定并做切片以便做HE染色和Z-N染色彩。结果见表2、3、4。

表2

对结核豚鼠脏器指数的影响(x±s)

组别剂量(g/kg)动物数(只)肝脏指数(g/100 g)脾脏指数(g/100 g)肺脏指数(g/100 g)

对照组103.63±0.43**0.16±0.03**0.92±0.15**

模型组106.13±1.020.62±0.381.54±0.72

抗痨胶囊5105.81±1.640.67±0.491.19±0.41

抗痨胶囊10105.68±0.660.31±0.17*1.43±0.65

抗痨胶囊20115.56±0.880.55±0.321.29±0.39

利福平50 mg/kg104.39±100**0.15±0.03**0.89±0.15**

注:与模型组比较:*P

从表2可见,豚鼠在感染结核菌后,其肝脏指数、脾脏指数及肺脏指数均显著增加,抗痨胶囊可降低结核豚鼠肝脏指数,与模型组比较有统计学差异;抗痨胶囊有减少结核豚鼠肝脏指数及肺脏指数的趋势,但与模型组比较无统计学差异;抗痨胶囊可显著减少结核豚鼠脾脏指数,与模型组比较有统计学差异。

表3

对结核豚鼠体重及肺结核结节数量的影响(x±s)

组别剂量(g/kg)动物数(只)体重(g)肉眼下肺结核结节动物数(只)

对照组10310.5±27.4**0**

模型组10232.7±50.19

抗痨胶囊510255.3±57.44

抗痨胶囊1010250.0±77.41**

抗痨胶囊2011259.8±6.72**

利福平50 mg/kg10317.4±37.1**0**

注:与模型组比较:*P

从表3可见,豚鼠在感染结核菌后,其体重显著减少,同时肺部形成大量肉眼可见的结核结节;抗痨胶囊对结核豚鼠体重均无明显影响,与模型组比较无统计学差异,但抗痨胶囊可减少结核豚鼠肺部肉眼可见的结核结节,与模型组比较有统计学差异。

表4

对结核豚鼠脾脏、肺脏组织培养结核菌数量的影响(x±s)

组别剂量(g/kg)动物数(只)肺结核菌(10*个/g组织)脾脏结核菌(10*个/g组织)

对照组100**0**

模型组1035.8±15.134.6±17.4

抗痨胶囊5100.38±0.25**0.44±0.38**

抗痨胶囊10100.04±0.04**0.05±0.04**

抗痨胶囊20100.02±0.03**0.03±0.06**

利福平50 mg/kg100.0002±0.0003**0.0003±0.0004**

注:与模型组比较:*P

从表4可见,结核菌感染的豚鼠肺脏和脾脏均有大量的结核杆菌;而抗痨胶囊可显著减少结核豚鼠肺脏及脾脏的结核菌数量,与模型组比较有统计学差异。

表5

对结核豚鼠脏器炎症积分的影响(x±s)

组别剂量(g/kg)动物数(只)肝脏炎症积分脾脏炎症积分肺脏炎症积分

对照组100±0**0±0**0±0**

模型组102.7±0.53.0±0.03.00±0.0

抗痨胶囊5102.0±0.01.3±0.5**2.0±0.0

抗痨胶囊10101.5±0.5*1.0±0.0**1.0±0.0*

抗痨胶囊20111.0±0.0**1.0±0.0**1.0±0.0**

利福平50 mg/kg101.0±0.0**1.4±0.5**1.0±0.0**

注:与模型组比较:*P

取肝脏组织、脾脏组织和肺组织置于10%福尔马林中固定后,用石蜡包埋,切片,HE染色后读片,并按下述标准进行打分:0分,无炎症改变;1分:细胞轻微肿胀;2分:渗出,白细胞浸润;3分:大量白细胞浸润,渗出,坏死。然后用秩和检验进行统计学分析。从表5可见:抗痨胶囊18 g/kg、36 g/kg可减轻结核豚鼠肝脏、脾脏及肺脏的炎性反应,与模型组比较有统计学差异。抗痨胶囊36 g/kg也可减轻结核小鼠肝脏的炎性反应,与模型组比较有统计学差异。

表6

对结核豚鼠脏器组织结核结节形成的影响(显微镜下)(x±s)

组别剂量(g/kg)动物数(只)结核结节形肝脏

成动物数(只)

脾脏肺脏

对照组100**0**0**

模型组10101010

抗痨胶囊510103*10

抗痨胶囊101062**10

抗痨胶囊201170**10

利福平50 mg/kg104*0**10

注:与模型组比较:*P

从表6可见,豚鼠在感染结核菌后,其肺脏、肝脏及脾脏均形成大量显微镜下可见的结核结节;抗痨胶囊有减少豚鼠形成肝脏结核结节动物数的趋势,但与模型组比较无统计学差异(χ2检验);但抗痨胶囊可显著减少豚鼠脾脏形成结核结节的动物数,与模型组比较有统计学差异;各药物对肺脏形成结核结节的动物学均无明显影响,与模型组比较无统计学差异。

表7

对结核豚鼠脏器结构菌(Z-N染色)的影响(x±s)

组别剂量(g/kg)动物数(只)肝脏积分脾脏积分肺脏积分

对照组100±0**0±0**0±0**

模型组101.5±0.51.5±0.52.0±0.0

抗痨胶囊5101.2±0.41.8±0.42.0±0.0

抗痨胶囊10101.8±0.41.0±0.01.4±0.5

抗痨胶囊20110.5±0.51.0±0.01.5±0.5

利福平50 mg/kg100.0±0.0**0.0±0.0**0.0±0.0**

注:与模型组比较:*P

取肝脏组织、脾脏组织和肺组织置于10%福尔马林中固定后,用石蜡包埋,切片,进行抗酸染色(即Z-N染色)以显示组织中的结核菌数量,染色后读片,并按下述标准进行打分:0分,未见抗酸杆菌;1分:3~9条/100个视野;2分:1~10条以上/每视野,然后用秩和检验进行统计学分析。从表7可见,抗痨胶囊均有减少各脏器的抗酸杆菌数量的趋势,但与模型组比较无统计学差异。

5 小结

我国是世界22个结核病高负担国家之一,结核病患者数量居世界第2位。2000年第四次全国结核病流行病学抽样调查显示,全国活动性肺结核患者病率为367/10万[4]。随着结核病的高发,在抗结核治疗过程中引起的药物性肝损害也明显增加,抗结核药所致的肝损害已成为我国药物性肝损害的重要原因[5]。目前抗结核治疗方案仍以异烟肼、利福平及乙胺丁醇联合应用为主,这些药物均可引起肝损害,甚至发生急性肝坏死致肝功能衰竭而死亡。因此从其他途径寻找毒性小并能有效防治肺结核的药物已是医药工作者主要研究课题之一。中药的特点是成分复杂,能从多方面起作用,达到根治疾病的目的。本项目拟从中药研究开发一个能有效防治肺结核的药物,本研究结果显示抗痨胶囊无论是体外或体内均可显著抑制结核菌的生长。现代研究表明百部有抑制结核杆菌生长的作用,而黄芪具有调节机体免疫功能的作用。其原因有待进一步探讨。

参 考 文 献

[1] 姚石安.中医治疗肺结核新方评析.浙江中医杂志,1993,4:187.

[2] 徐叔云,卞如濂,陈修.药理实验方法学.人民卫生出版社出版,2002:1712-1720.

[3] 卢润生,刘传金,漆浩珊,等.结核菌实验动物模型探讨.中国防痨通讯,1990,12(3):118.

[4] 刘敬东.结核病的“复燃”及其防治对策.国外医学流行病学传染病学分册,2004,31(6):321.

[5] 吴苑珊,郑金琨,黎月玲,等.509例药源性肝损文献分析.药物不良反应杂志,2002,4(6):364.