葛根素预处理对缺血再灌注心肌脂质过氧化与内质网应激的影响

【摘要】 目的：观察葛根素预处理对缺血再灌注（I/R）大鼠心肌内质网应激（ERS）与细胞凋亡的影响。方法：采用随机数字表法将24只大鼠分为假手术组（SH组），缺血再灌注组（I/R组），葛根素预处理组（PU组）三组，每组8只。实验结束测定心肌丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）的含量以及GRP78 mRNA、CRT mRNA的表达。结果：与SH组比较，其余两组GRP78 mRNA与CRT mRNA表达、心肌MDA含量均明显增加，而心肌SOD水平明显降低（P

【关键词】 葛根素； 缺血再灌注； 内质网应激； 脂质过氧化

心肌缺血再灌注（I/R）过程中由于钙超载、脂质过氧化、缺氧等多种因素可导致内质网应激（ERS），适当的ERS可诱导多种保护蛋白表达上调，增强细胞对缺血再灌注损失的耐受能力，但持续而严重的ERS则诱发内质网凋亡信号通路导致细胞凋亡和组织损伤[1-2]。研究表明葛根素（puerarin，Pue）可以通过多种途径减轻I/R导致的心肌损伤[3-4]。因此，本研究通过复制大鼠心肌缺血再灌注损失实验模型，探讨葛根素对缺血再灌注心肌脂质过氧化和ERS的影响。

1 资料与方法

1.1 动物及试剂 健康雄性SD大鼠24只（重庆医科大学实验动物中心），葛根素注射液（浙江康恩贝制药股份有限公司），PCR试剂盒（北京天根产品），总RNA提取及逆转录试剂盒（Takara公司），丙二醛（Malondialdehyde， MDA）和超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase， SOD）测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）。

1.2 实验分组 雄性SD大鼠24只按照随机数字表法分成三组，每组8只。假手术组（SH组）：开胸后，在冠状动脉左前降支下穿线但不结扎，在穿线前15 min经颈静脉注射生理盐水（2.5 mL/kg），连续观察150 min。缺血再灌注组（I/R组）：在结扎冠状动脉左前降支前15 min经颈静脉注射生理盐水（2.5 mL/kg），结扎30 min，再开放120 min[5-6]。葛根素预处理组（PU组）：结扎前15 min经颈静脉注射Pue（2.5 mL/kg），余同I/R组[7]。

1.3 测定指标 将心肌细胞研磨成匀浆，以3000 rpm离心15 min，吸取上清液置管封存冷冻。运用硫代巴比妥酸法测定心肌组织MDA含量，分光光度计法测定心肌组织SOD活性，并参考文献[7]行RT-PCR检测心肌组织葡萄糖调节蛋白78（GRP78）和钙网蛋白（CRT）mRNA的表达。

1.4 统计学处理 采用SPSS 16.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，比较采用t检验，计数资料采用 字2检验，以P

2 结果

2.1 葛根素预处理对心肌MDA、SOD水平的影响 与SH组比较，其余两组心肌MDA含量显著增多，SOD水平明显降低（P

2.2 葛根素预处理对心肌GRP78、CRT mRNA水平的影响 与SH组比较，I/R组、PU组GRP78、CRT mRNA表达水平均增高（P

3 讨论

氧自由基大量产生并通过过氧化反应造成组织细胞损伤是I/R损伤的主要机制之一，主要损害为细胞膜不饱和脂肪酸的过氧化反应，产生脂质过氧化物，使生物膜结构受到严重损害。MDA是细胞内发生脂质过氧化反应的终产物，是反映体内氧化应激反应的重要指标之一，其含量多少可反映细胞膜脂质过氧化的程度，可间接反映细胞损伤程度[8]。SOD是广泛存在于需氧物体内的一种金属酶，能催化超氧阴离子自由产生歧化反应，是体内最为重要的自由基清除剂[9]。研究表明葛根素可减轻心肌脂质过氧化和钙超载损失，提高氧自由基清除能力，改善组织微循环，提高心肌细胞能源储备达到对心肌I/R损伤的保护作用[5-6]。本实验显示，与I/R组比较，PU组脂质过氧化产物MDA生成减少、自由基清除酶SOD活性上调，提示葛根素可减轻脂质过氧化反应。

内质网是真核细胞中重要的细胞器之一，在调节蛋白质合成、折叠、降解和分泌，以及调节细胞应激反应等方面具有重要作用。I/R过程中由于钙超载、脂质过氧化、缺氧等多种因素均可致内质网内未折叠或错误折叠蛋白质的聚集、内质网功能障碍、钙稳态失衡等，即触发ERS[1]。ERS可通过三条信号途径诱发应激反应，其中未折叠蛋白反应途径（unfolded protein response，UPR）是发现较早、了解较多的一条ERS途径，UPR是由一个内质网分子伴侣GRP78和3个内质网应激感受蛋白所传导的。ERS时，使GRF78从3种内质网应激感受蛋白上解离，与内质网内堆积的未折叠蛋白结合，促进其折叠和降解。GRF78解离后，使无活性的ER应激感受蛋白被激活并启动UPR，进一步减少未折叠或错误折叠蛋白的积累，促进内质网正常功能的恢复。3个ER应激感受蛋白不仅能够启动ERS的生存途径，严重或长时间的ERS将诱发细胞凋亡途径，加速细胞凋亡[1]。GRP78是ERS的标志性分子伴侣蛋白，其急速上调被认为是ERS最敏感的标志[10]。CRT是ER内重要的钙结合蛋白，参与协助蛋白质转运以及正确折叠，维持细胞内钙稳态、减轻细胞凋亡等[11]。本研究显示，I/R组与PU组均使GRP78和CRT mRNA表达上调，而PU组升高幅度较I/R组低，即PU组可诱导GRP78和CRT mRNA表达轻度增加，表明葛根素预处理可减轻I/R导致的过度ERS，进而减轻心肌细胞损失。

研究表明应用外源性SOD和过氧化氢酶作用于大鼠I/R心肌，发现其可改善内质网功能，提高细胞对钙的处理能力，表明抑制脂质过氧化反应是保护内质网功能、减轻过度ERS的一种重要机制[12]。而本研究显示，PU组脂质过氧化产物MDA生成减少、自由基清除酶SOD活性上调，且GRP78和CRT mRNA表达轻度增加，表明葛根素预处理可能通过减轻脂质过氧化反应，缓解I/R激发的过度ERS。

综上所述，葛根素预处理可能通过减轻心肌脂质过氧化反应，抑制I/R导致的过度ERS而发挥心肌保护作用。

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（收稿日期：2013-11-11） （本文编辑：黄新珍）11