JNK通路对亚急性帕金森病MPTP模型小鼠黑质COX?2表达的影响

作者：王永生 魏子峰 张作凤 周洪霞 张宇新

【摘要】

目的：研究JNK在1?甲基?4?苯基?1，2，3，6?四氢吡啶（MPTP）所致小鼠帕金森病（PD）模型中对环氧合酶?2(COX?2)的表达调控作用，以探讨可能导致PD黑质多巴胺(DA)能神经元变性失活的机制. 方法：采用MPTP制备亚急性PD小鼠模型,观察模型小鼠行为学变化，观察PD模型小鼠黑质区酪氨酸羟化酶（TH）,COX?2,磷酸化c?Jun的表达变化；观察给予JNK通路特异性抑制剂SP600125对上述变化的影响. 结果：与对照组小鼠相比，模型组小鼠出现典型PD症状，在MPTP第3次注射后6 h，黑质区COX?2阳性细胞显著增加，p?c?Jun特异性表达于黑质区细胞核内，在MPTP第5次注射后7 d，黑质区TH阳性神经元显著丢失65% (P<0.01)；经SP600125处理后，模型小鼠PD症状减轻，与对照组比较，在MPTP第5次注射后7 d，TH阳性细胞数仅下降约15%，与模型组比较，在MPTP第3次注射后6 h，黑质区COX?2阳性细胞明显减少(P<0.01)，黑质区p?c?Jun表达于细胞质内. 结论：JNK通路在亚急性PD MPTP模型早期对黑质COX?2表达中可能起重要调控作用；抑制JNK通路对PD小鼠具有神经保护作用.

【关键词】 帕金森病 炎症 环氧合酶?2 c?Jun氨基末端激酶 磷酸化c?Jun

0引言

帕金森病（Parkinson?s disease, PD）是一种常见的中老年人神经系统变性疾病，其发病机制仍未完全阐明. 研究认为，炎症可能在PD发病过程中起重要作用［1］, 环氧合酶?2((COX?2)及其介导的炎症反应可能参与PD发病过程［2］. JNK通路可能参与对炎症反应的调控［3］. 我们采用MPTP（1?甲基?4?苯基?1，2，3，6?四氢吡啶）制备亚急性PD模型，观察模型动物中脑黑质p?c?Jun和COX?2表达与TH阳性神经元数量关系以及给予JNK特异性抑制剂SP600125后对上述改变的影响，探讨JNK通路是否参与COX?2表达的调控，为PD多巴胺能神经元变性死亡的分子机制和寻找PD有效的防治策略提供理论依据.

1材料和方法

1.1材料① 动物：健康雄性C57BL/6N小鼠45只，8~12周龄，体质量25~30 g，购于北京通利华实验动物技术有限公司［SCXX（京）2002?0003］，自由进食饮水，室温（25±2）℃，单笼喂养，自然光照. ② 试剂：MPTP（Sigma, USA）,兔抗人COX?2 mAb(福州迈新生物),小鼠抗人TH mAb(Chemicon, USA)，兔抗人p?c?Jun mAb（Ser63, Cell Signaling Technology, USA），SP600125(Calbiochem, USA), UltraSensitiveTMSP超敏试剂盒(福州迈新生物).

1.2方法

1.2.1动物分组和模型制备实验动物随机分为3组，每组15只. 模型组（Model）：腹腔注射MPTP（30 mg/kg,生理盐水溶），1次/d,连续5 d；JNK抑制剂组（Inhibitor）：在第1次MPTP注射前4 h经侧脑室定位注射给予JNK 通路抑制剂SP600125（3 g/L,溶于10 g/L DMSO）一次；对照组（Control）：注射与模型组和抑制剂组等体积的生理盐水和10 g/L DMSO. 于每次注射药物后观察小鼠行为变化, 判断PD鼠模型是否成功.

1.2.2定位注射200 g/L氨基甲酸乙酯腹腔麻醉，动物腹卧位固定，作颅顶正中切口，以25 μL微量注射器作为注射针，进行立体定位，注射坐标为: AP-0.4 mm, ML+1.5 mm, DV-2.2 mm. 注射量5 μL，15 min内匀速注射完后留针10 min, 关闭伤口.

1.2.3标本采集动物分别于MPTP第3次注射后6 h和MPTP最后1次注射后7 d处死. 动物麻醉后，行40 g/L多聚甲醛磷酸盐缓冲液常规灌注固定，迅速开颅取脑，40 g/L多聚甲醛后固定48 h（4℃），石蜡包埋、切片. MPTP第3次注射后6 h所取的标本用于判定JNK通路是否调控COX?2 表达；MPTP最后一次注射后7 d所取的标本用于判定PD模型是否复制成功［4］.

1.2.4免疫组化脑组织切片常规脱蜡至水后，用TBST（pH 7.4±0.2）洗3次，每次3 min；组织抗原行水浴法热修复；30 mL/L过氧化氢阻断内源过氧化物酶，TBST洗3次；用正常非免疫动物血清室温孵育10 min；同一组织相邻切片分别加入兔抗人COX?2 mAb（1∶100）,小鼠抗人TH mAb（1∶400),兔抗人p?c?Jun抗体（Ser63,1∶100），4℃过夜；TBST洗3次后，加入生物素标记第二抗体室温孵育20 min；TBST洗3次，加入链霉素抗生物素蛋白?过氧化酶室温孵育20 min，DAB显色，中性树胶封固，光镜下观察照像. 用DA能神经元特异性标志酶酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase，TH）判定模型小鼠黑质区DA能神经元变化；用炎症标志性酶COX?2观察黑质区炎症变化；用JNK特异性活性底物磷酸化c?Jun（Ser63, p?c?Jun）观察JNK信号通路变化.

统计学处理： 选定黑质所在区域，采用CMIAS真彩色医学图像免疫组化自动分析系统进行阳性细胞计数. 各组每只动物的6张脑片数值相加后取平均值，结果以x±s表示，使用SPSS 11.0统计软件行方差分析及LSD?t检验，COX?2表达组间差异比较用非参数秩和检验. P<0.05为差异有统计学意义.

2结果

2.1PD模型小鼠行为学变化模型鼠于第1次注药后15～20 min均出现不同程度的震颤、竖毛、翘尾，MPTP最后1次注射后，模型鼠出现步态蹒跚、活动减少、动作变慢、前后肢协调性差等症状；对照组未出现上述行为学变化；JNK抑制剂组与模型组比较上述行为学症状明显减轻，7 d后与对照组比较运动功能无统计学差别.

2.2黑质区TH阳性神经元数量变化在MPTP第3次注射后6 h和MPTP最后1次注射后7 d，对照组黑质致密部可见大量TH阳性神经元，且排列整齐，呈条带状. 模型组与对照组相比，可见TH阳性细胞明显减少，差异有统计学意义(P<0.01,图1,表1）.表1各组酪氨酸羟化酶(TH)阳性细胞数

2.3PD模型动物黑质区出现COX?2高表达在MPTP第3次注射后6 h，模型组可见大量COX?2阳性细胞；对照组偶见COX?2阳性细胞. 经图像分析，差异有统计学意义（P<0.01,图2，表2）.表2JNK抑制剂对黑质区环氧合酶?2(COX?2)表达和酪氨酸羟化酶(TH)阳性细胞数的影响

2.4JNK抑制剂可下调COX?2表达，减少TH阳性细胞丢失在MPTP第3次注射后6 h，对照组黑质区可见微量的p?c?Jun表达于胞质；模型组黑质区出现大量p?c?Jun阳性细胞，排列整齐，呈现与TH阳性细胞一致的条带状分布，且p?c?Jun表达于细胞核内. JNK抑制剂组p?c?Jun主要表达于胞质，阳性细胞排列整齐呈条带状，且黑质区COX?2阳性细胞数量明显减少，黑质区TH阳性细胞丢失现象减轻. 经图像分析，差异有统计学意义（P<0.01,图2,3,表2）.

3讨论

MPTP能选择性损害黑质多巴胺能神经元，是目前公认研究PD发病机制最好的动物模型之一［4］. 我们采用MPTP(30 mg/kg, 1次/d,连续5 d)制备亚急性PD动物模型,结果显示，在MPTP最后1次注射后7 d，模型组黑质区TH阳性神经元显著减少，模型动物出现震颤、竖毛、翘尾，步态蹒跚，活动减少，动作变慢，前后肢协调性差等神经病理学及行为学特征，表明PD模型复制成功.

近年来，愈来愈多的实验证据提示在PD中存在炎症，炎症可能是构成PD神经系统进行性退变的病理学基础［5］. C0X?2是炎症介质前列腺素E2合成的限速酶，可作为炎症反应的重要生物学指标［2］. 本实验结果显示，在MPTP第3次注射后6 h，模型组小鼠黑质区有大量COX?2阳性细胞，TH阳性神经元大量缺失. 这提示，黑质区DA能神经元大量缺失可能与黑质区COX?2大量表达密切相关. 研究发现，PD患者脑中有COX?2高表达［6］；在6?羟基多巴胺模型中，中脑黑质区亦见COX?2阳性细胞；COX?2基因敲除或采用COX?2抑制剂，均可使DA能神经元变性丢失减少. 本室的前期工作发现，MPTP模型中COX?2表达与DA能神经元变性丢失有密切关系［2］. 以上证据提示COX?2在PD发病机制中可能起重要作用，COX?2可能是DA能神经元变性丢失的关键事件.

实验表明，JNK通路可能有助于炎症反应的发生［7］. 一般认为，JNK通路是由应激条件激活，活化的JNK激酶磷酸化其特异性底物c?Jun核转录因子，p?c?Jun进入核内影响基因的表达调控［7］. 在关节炎等炎症性疾病中JNK通路通过磷酸化c?Jun转录因子可上调COX?2表达，调控COX?2介导的炎症反应［3］. 本实验中，在MPTP第3次注射后6 h，模型组黑质区p?c?Jun阳性细胞显著增加，阳性细胞分布与TH阳性细胞相一致，且p?c?Jun表达于细胞核内，相邻切片黑质区可见大量COX?2阳性神经元，TH阳性神经元显著减少；在同一时间点的JNK抑制剂组，经JNK特异性抑制剂 SP600125侧脑室注射后，p?c?Jun表达于胞质而非细胞核内，同时相邻切片黑质区COX?2阳性神经元显著性减少，TH阳性神经元仅较对照组减少约15%；同一时间点对照组，黑质区可见微量表达于胞质的p?c?Jun阳性细胞和COX?2阳性细胞. 该结果表明，在本实验条件下，MPTP可导致JNK通路被激活，p?c?Jun出现核移位并上调COX?2表达；JNK特异性抑制剂SP600125可在一定程度上阻抑p?c?Jun进入核内而干扰JNK信号通路，使其不能上调COX?2表达，从而降低黑质区COX?2介导的炎症反应，使黑质DA能神经元免于MPTP诱导的损伤，最终使该模型小鼠运动功能障碍得到改善. 上述现象Hunot等［8］在MPTP制备的急性小鼠PD模型中也得到证实. 上述实验结果提示，JNK通路可能是MPTP所致急性与亚急性PD模型黑质COX?2炎症反应表达调控的重要事件；抑制JNK信号通路对MPTP模型黑质细胞具有保护作用.

【参考文献】

［1］ Hald A, Lotharius J. Oxidative stress and inflammation in Parkin?son?s disease: Is there a causal link［J］? Exp Neurol, 2005, 193(2): 279-290.

［2］ 师亮，张宇新，张作风，等. COX?2对帕金森病小鼠黑质内多巴胺能神经元的毒性作用［J］. 第四军医大学学报, 2006, 27(18): 1661-1664.

［3］ Nieminen R, Leinonen S, Lahti A, et al. Inhibitors of mitogen?activated protein kinases downregulate COX?2 expression in human chondrocytes［J］. Mediators Inflamm, 2005, 2005(5): 249-255.

［4］ Smeyne RJ, Jackson?Lewis V. The MPTP model of Parkinson?s disease［J］. Brain Res Mol Brain Res, 2005,134(1):57-66.

［5］ Wang T, Pei Z, Zhang W, et al. MPP+?induced COX?2 activation and subsequent dopaminergic neurodegeneration［J］. FASEB J, 2005, 19(9):1134-1136.

［6］ Chen H, Zhang SM, Hernan MA, et al. Nonsteroidal anti?inflammatory drugs and the risk of Parkinson disease［J］. Arch Neurol, 2003, 60(8):1059-1064.

［7］ Xia XG, Harding T, Weller M, et al. Gene transfer of the JNK interacting protein?1 protects dopaminergic neurons in the MPTP model of parkinson?s disease［J］. Proc Natl Acad Sci U S A, 2001, 98(18): 10433-10438.

［8］ Hunot S, Vila M, Teismann P, et al. JNK?mediated induction of cyclooxygenase 2 is required for neurodegeneration in a mouse model of Parkinson?s disease［J］. Proc Natl Acad Sci U S A, 2004,101(2): 665-670.