试论盐芥miRNA393沉默载体的构建

摘要将与内源mrna编码区同源的小片段外源双链rna导入细胞中,通过一系列细胞内反应引发细胞中相应mrna降解,可导致特定基因表达沉默。通过pcr扩出与mirna399互补的ips,并改造成与mirna393互补的ips′,测序正确后酶切连入3301h载体转化盐芥。

关键词盐芥;mirna393;沉默载体;构建

中图分类号q752文献标识码a文章编号 1007-5739(2010)23-0011-01

constructionofmirna393silencedvectorinthellungiellasalsuginea

chen long-junhou leiji hong-fei

(college of life science,shandong normal university,jinan shandong 250014)

abstractwhen guides small exogenous dsrnas to cells that are homologic to their endogenesis rna′s protein coding region,they can lead specific gene to silence by series of reactions which bring in-cell′s corresponding mrna to degrade. the gene ips which complementary to mirna399 sequence was firstly received and it was reconstructed to ips′ that contains a region complementary to mirna393. after making sure the sequce right,they connected the aid gene with the 3301h empty vector.

key wordsthellungiella salsuginea;mirna393;silent vector;construction

作为一种小rna,mirna很难得到它的缺失突变体。因为每个mirna家族中有多个成员,各成员核苷酸序列相似,仅把其中一个沉默,并不影响靶基因的剪切,不会出现预期表型。为mirna研究带来一定困难。2007年,jose′ manuel franco-zorrillal等在研究低磷诱导的mir399时,发现了一个非编码的ips1,ips1具有短的不保守的开放读码框,有编码四肽(met-ala-ile-pro)的潜能[1-2]。并且具有一个23 bp的基序,该基序是保守的,并且其能够与mir399互补配对。然而这种互补配对并不完美,而是存在一个关键错配,在mirna的10~11座位形成1个突起的环。而这个区域的序列互补恰恰对于mirna指导的mrna的剪切十分重要[3-4],为获得mirna沉默突变体带来了方便。目标模拟[5-6]为人们提供了一种新的策略来抑制特异mirna的活性。

1材料与方法

1.1试验材料

供试材料:盐芥(t.halophila)。供试菌株:大肠杆菌(e.coli)菌株为dh5α;农杆菌(agrobacterium tumefaciens)菌株为gv1301菌株。载体:pmd18-t,3301h。

1.2试验方法

1.2.1制备目的基因。用ips1-5′/ips1-3′从盐芥中扩出ips序列。用ips1-5′-2/ips1-3′以ips为模板pcr扩增出ips3′端。用改造的ips-393-3′/ips1-5′以ips为模板pcr出ips5′端。3′端/5′端用hindiii酶切连接。以改造的ips393为模板用ips1-5′/ips1-3′为引物进行扩增。

1.2.2连接转化。将pcr产物电泳分离,用gene clean法回收。回收产物与t载体连接。挑dh5a单菌落于lb液体培养基中,37 ℃振荡培养12 h;取500 μl加入50 ml lb中,培养至od600=0.5;菌液冰浴30 min;4 ℃、5 000 r/min离心10 min;弃上清,加入8 ml预冷的无菌0.1 mol/l cacl2溶液重悬;4 ℃、5 000 r/min离心5 min,弃上清;用1 ml预冷的0.1 mol/l cacl2重悬,200 μl/份分装,加入适量连接产物混匀,冰浴30 min;42 ℃处理90 s,冰浴2 min;加入1 ml的lb,于37 ℃振荡1 h;涂板37 ℃过夜培养。

1.2.3提质粒。挑单菌落于3 ml lb中,37 ℃过夜。收集菌体5 000 r/min离心1 min,重复1次。弃上清,加入200 μl solutionⅰ 重悬;加入300 μl solutionⅱ,混匀;加入300 μl solutionⅲ,混匀;加等体积氯仿混匀,于11 000 r/min离心10 min,取上清加等体积异丙醇,-20 ℃沉淀30 min;13 000 r/min离心15 min;去上清,加入500 μl 70%乙醇洗涤;13 000 r/min离心3 min,弃上清;60 ℃烘干溶解加2 μl rnase,37 ℃消化。在10 μl反应体系中加入1 μl质粒、1 μl 6×loading buffer、7.7 μl无菌水0.3 μl的pst、1%琼脂糖电泳(5 v/cm)检测。

1.2.4pcr及产物回收连接与转化。以上述质粒为模板pcr,电泳检测用gene clean法回收dna。连接。挑gv 1301单克隆于50 ml lb中,28 ℃、220 r/min振荡培养至od600=0.5; 5 000 r/min离心5 min,弃上清;菌体用10 ml预冷0.15 mol/l nacl重悬;5 000 r/min离心5 min,弃上清;用3 ml预冷的20 mmol/l cacl2重悬;200 μl中加3 μg重组质粒,冰浴30 min;液氮冷冻1 min;37 ℃融化细胞3 min;加1 ml lb,28 ℃振荡培养3 h;离心1 min,用0.1 ml lb重悬涂布于含50 μg/ ml卡那、50 μg/ml利福平的lb平板上,28 ℃培养2 d;筛出的克隆扩大培养。

1.2.5提质粒,酶切验证正确后侵染盐芥花序。保存菌种,将剩余菌液倒入ep管中,5 000 r/min离心1 min。弃上清,重复1次,沉淀悬于200 μl solution ⅰ中。加入200 μl solutionⅱ(现用现配),混匀,冰浴5 min。加入300 μl solutionⅲ,混匀,冰浴5 min。加等体积氯仿,混匀,11 000 r/min离心10 min,取上清加入预冷的等体积异丙醇,-20 ℃沉淀30 min。13 000 r/min离心15 min。去上清,沉淀加入500 μl 70%乙醇洗涤。13 000 r/min离心3 min,倒去乙醇。60 ℃烘干。每管中加入38 μl无菌水及2 μl的rnase,于37 ℃消化。电泳检测质粒。

2结果与分析

把ips′连入pmd18-t,测序,ips两端有ecor i/bamh i酶切位点,酶切正确后ecor i / bamh i酶切下这个片段,连入3301h载体(含35s启动子)。图1为酶切结果。由图1可看到约500 bp的片段,表明ips′片段已经成功连入载体。

3结论与讨论

ips1存在1个能与mirna399互补23 bp的保守区域。但是其与mirna399存在一段非常重要的错配,在mirna399的10~11 bp处形成一突出小环。mirna399的这一位置对mirna调节靶基因使其降解是必须的。这一位置的错配将导致mirna399不能使其降解,ips1的错配环对沉默mirna 399是非常重要的。

本试验利用拟南芥中ips与mirna399互补但不被降解的特征,利用hindⅲ酶切位点改造构建了与mirna393互补的ips′,这一错配环将使mirna393功能沉默。成功构建了mirna393沉默载体,为以后研究mirna393的功能打下了基础。 编辑

4参考文献

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