Hec1在肝细胞癌中的表达和意义及其与AFP之间的关系

【中图分类号】R735【文献标识码】A【文章编号】1672－3783(2011)08－0274－01

【摘要】目的 研究癌症高表达蛋白(hec1)在肝细胞癌(HCC)中的表达，并探讨Hec1的表达与Hcc临床病理特征、afp及HBV感染之间的关系。方法 采用免疫组织化学SABC法检测40例HCC组织及相应癌旁组织和14例正常肝组织中Hec1蛋白的表达，同时采用RT-PCR检测上述三种不同组织中Hec1mRNA的表达水平，比较不同组织中表达的差异。结果 40例HCC组织中27例Hec1表达阳性，阳性率为67.5% , HCC组织中Hec1的表达均高于相应的癌旁组织和正常肝组织(P < 0. 05) 。同时Hec1的表达与HCC的Edmondson分级、侵袭转移显著相关( P < 0.05)。结论 Hec1蛋白在HCC组织中呈高表达，与Edmondson分级、侵袭转移显著相关。提示Hec1蛋白的过度表达可能在HCC的发生发展中起重要作用。

【关键词】肝细胞癌，癌症高表达蛋白，AFP，侵袭转移

肝细胞癌（HCC）是我国常见的恶性肿瘤之一。深入研究肝癌的发生的机制，特别是从基因水平上研究，有可能对肝癌的诊断、治疗和预后取得突破性进展。癌症高表达蛋白（Hec1）是利用Rb蛋白C端通过酵母双杂交筛选人B淋巴细胞cDNA文库是发现的，有研究表明Hec1 mRNA仅能在有丝分裂活跃的组织中检测到，如、肾及胸腺。目前，国内外有关Hec1与肿瘤侵袭、恶性程度及预后等的关系还不是很清楚，特别是与HCC的关系。

1 资料和方法

1.1 一般资料 实验所用组织标本取自2007年3月―2008年10月病理诊断明确的HCC组织。共计40例。其中男34例，女6例，年龄36.5―68.1岁，平均53.2±10.8岁。按照Edmondson分级，Ⅰ级5例，Ⅱ级8例，Ⅲ级13例，Ⅳ14例，患者肝功能按Child分级，A级23例，B级17例。HCC侵袭转移条件为［15］①肝门淋巴结转移；②肝内肿瘤数目≥2个；③门静脉癌栓形成；④癌周多个卫星结节形成；⑤癌组织浸润破坏肿瘤包膜。凡符合上述条件中的1项以上者定为侵袭转移组，共29例（其中肝门淋巴结转移20例，门脉癌栓11例，包膜侵袭10例，肝内转移8例），凡不符合上述5项条件者为无侵袭转移组，共11例。患者AFP阳性26例，阴性14例，乙肝标志物阳性32例，阴性8例，伴肝硬化31例。

1.1.1 癌旁组织：取自上述40例HCC患者距肿瘤为2cm的肝组织。

1.1.2 正常肝组织:取自2007年3月―2008年10月切除的肝血管瘤周围正常肝组织，共计14例。（均已排除HBV感染及肝硬化）

1.1.3 实验分组:a 肝细胞癌组 40例 b 癌旁组 40例 c 正常组 14例

1.1.4 Edmondson分级法：对癌细胞进行分级。

2 实验方法

2.1 组织切片的制备

2.2 HE染色

2.3 免疫组化染色：（1）洗载玻片（2）包埋组织（3）切片（4）捞组织（5）脱蜡（6）抗原修复（7）血清封闭（8）加一抗（9）加二抗（10）加SABC（11）加显色剂（12）复染（13）脱水（14）封片

2.4 RT-PCR

2.4.1 肝细胞癌患者癌组织AFP mRNA测定（定性）

2.4.2 不同组织Hec1 mRNA测定（半定量）

2.4.3 组织总RNA的提取

2.4.4 RNA的检测：包括RNA纯度检测、RNA完整性检测。

2.4.5 RT-PCR反应条件:RT-PCR采用宝生物Two step RNA PCR Kit（AMV）试剂盒，具体反应体系参见说明书推荐体系，本实验中，阴性对照以无RNA酶的去离子水代替RNA样品作为阴性对照。

PCR反应体系为40μl：5×PCR buffer 10μl，Upstream PCR primer（20μM）0.5μl，Downstream PCR primer（20μM）0.5μl，Taq 0.25μl，Rnase Free H2O 28.25μl。

2.5 结果判定:免疫组化 Hec1以细胞核染成淡黄或棕黄色为阳性，在400倍光镜下观察20个视野，每个视野计数200个细胞，阳性细胞数记分:75%为4分；染色强度记分:淡黄色为1分，黄色为2分，棕黄色为3分；组织化学积分(两记分的乘积):>1为阳性，≤1为阴性。

2.6 统计学分析:本实验中所有数据采用SPSS11.5统计软件进行分析。计量资料采用t检验或单因素方差分析，计数资料采用χ2检验，P

3 结 果

3.1 Hec1在HCC组织中的表达:Hec1主要在细胞核表达，阳性表达的细胞核根据表达的强度呈现淡黄色、黄色或棕黄色。HCC组织中Hec1表达阳性率为67.5%。癌旁组织中Hec1表达阳性率为25%，正常肝组织中Hec1未见表达，各组织中Hec1的表达差异有显著统计学意义（P＜0.05）；详见表1

3.2 Hec1在HCC组织中的表达与临床病理特征的关系:在40例HCC组织中，Hec1表达阳性率为67.5%，而随着Edmondson分级的增加，Hec1的阳性率逐渐增高，各级分级间Hec1的阳性表达均有差异且具有统计学意义（P＜0.05）详见表2。在转移倾向组中Hec1表达阳性率为79.31%，无转移倾向组中Hec1表达阳性率为36.36%。两者Hec1的阳性表达差异有统计学意义（P

在癌旁组织由于受到恶性肿瘤的刺激，有丝分裂也趋于旺盛，因此Hec1也出现了表达。在癌组织中，Hec1的表达逐渐增强，是机体自身的保护作用（通过增加Hec1的表达，企图恢复正常的有丝分裂），还是一种有丝分裂的进一步失调。还有待进一步研究。国内有学者研究证明在肝细胞癌中，Hec1的蛋白表达与肿瘤的病理分级及转移倾向相关，这与我们的研究结果类似。

4.2 Hec1在HCC中的表达与AFP的相关性:结果发现在HCC中，Hecl和AFP的表达水平呈现正相关。可能是Hec1作为一种与有丝分裂有关的白其表达异常可导致AFP基因的激活，或者反之AFP的激活可能影响Hec1的表达。同时，在临床工作中我们也注意到在肝癌的诊断过程中，AFP存在假阳性及假阴性的情况，一些其他的病理情况可能导致AFP阳性，如活动性肝炎，妊娠等，而组织中的AFPmRNA阳性表达极高，但在临床诊断过程中，因其为一种有创的诊断方式且费用相对较高。患者要承受一定程度的创伤及疼痛而不易被患者接受，尤其在高危人群的体检筛查中难以开展，据文献报道外周血中检测到的AFPmRNA系来自癌灶脱落入血的完整肝癌细胞，因此，如果结合外周血AFPmRNA的检测，则与血清AFP有互补性，对血清AFP阴性的部分HCC患者可作出诊断，提高诊断的准确率，同时因其与Hec1的表达呈正相关，故检测外周血AFPmRNA，可能可以用来作为评估术前肝癌患者的肿瘤恶性程度，及正确预测愈后的一个指标。

4.3 Hec1与HBV感染的相关性:乙肝病毒(HBV)与HCC的发生密切相关，这已经为人和动物中的许多研究所证实。HBV感染是导致HCC的重要病因，但HBV具体致癌机理目前仍不完全清楚。目前研究表明HCC的发生与HBV在染色体上的整合及整后染色体的重排有关；有报道HBV相关性HCC组织中，均有HBV整合，整合的HBV可能导致了基因变异； HBV中编码17kd的多功能x蛋白的基因称为HBx基因，为病毒基因转录所需，并被认为与HBV感染相关性HCC的发生发展相关。研究发现,细胞在DNA损伤因素的作用下,HBx可能通过抑制p21waf1的表达降低,引起停滞在G0~G1期的细胞减少，导致肿瘤细胞仍能继续分裂增殖形成恶性生长。而我们所关注的Hec1蛋白与细胞的分裂增殖密切相关，HBV是否通过HBx蛋白导致Hec1表达的失调从而导致肿瘤的发生发展，本实验结果显示肝细胞癌的Hec1蛋白表达与HBV感染密切相关，提示HBV感染可能是导致肝癌基因突变、Hec1表达改变的重要原因，但两者的关系需要我们进一步研究证明。在此基础上进一步探讨了Hec1与AFP表达及HBV感染的关系，我们发现Hec1的表达水平与AFP表达水平及HBV感染密切相关。

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作者单位：410100 湖南省长沙市第八医院普外科