冰灯玉露离体诱变技术

摘 要：为了获得冰灯玉露新品种，采用冰灯玉露松散型胚性愈伤组织为诱变试材，采用浸泡法和在培养基中加入诱变剂的方法进行离体诱变。通过采用不同浓度EMS和不同处理时间，找到愈伤组织半致死剂量的EMS使用浓度和时间，并在此条件下对冰灯玉露松散型胚性愈伤组织进行离体诱变，获得形态变化的突变体。结果显示，采用在培养基中加入0.1%EMS处理4 d可以获得理想的半致死效果。以此条件处理冰灯玉露愈伤组织，通过再生培养可以获得1.5%的形态变异的个体，这些个体的遗传变异情况有待进一步检测。

关键词：冰灯玉露；半致死剂量；诱变剂；愈伤组织

中图分类号：S682.36 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2017.07.007

Study on in Vitro Mutagenesis of Haworthia cooperivar

ZHOU Haicheng， LIU Yanjun，HUANG Junxuan，YANG Jinghui，LI Jianke，WU Chunxia

（College of Horticulture and Landscape Architecture， Tianjin Agricultural University， Tianjin 300384， China）

Abstract：In order to obtain the new variety of Haworthia cooperivar， the embryogenic callus of Haworthia cooperivar was used as mutagenic material. The mutagenesis in vitro was experimented by immersion method and the method by adding mutagen in medium. By using different concentration of EMS and different treatment time， the median lethal dose was found. The embryogenic callus of Haworthia cooperivar was mutated in vitro by this method， and the mutant of morphological change was obtained. The results showed that the ideal median lethal dose could be obtained by adding 0.1% EMS to the medium and treating for 4 days. By this method， after the callus regenerated， 1.5% of the morphological variation individuals were obtained， but the genetic variation of these individuals need to be further tested.

Key words： Haworthia cooperivar； median lethal dose； mutagen； callus

冰灯玉露（Haworthia cooperivar）属于百合科十二卷属的多年生肉质草本植物，作为玉露中的极品，冰灯玉露的叶片晶莹剔透，奇特而美丽。近年来，越来越受到多肉花卉爱好者的青睐。虽然一些花卉栽培者收集各种玉露品种，并通过杂交育种手段培育出一批新的品种，但仍然难以满足市场的需求[1-3]。近年来关于体细胞诱变育种的研究报道很多，在许多植物上已经得到了应用[4-8]。

冰灯玉露在组培方面虽有少量报道[9-10]，但采用离体诱变技术进行育种的研究很少。本试验以观赏多肉植物-冰灯玉露为试材，采用体外化学诱变方法，对其愈伤组织进行诱变处理，寻找诱变的适宜剂量和诱变方法，为冰灯玉露等多肉植物离体诱变育种研究提供一定的参考。

1 材料和方法

1.1 材 料

本试验中采用的试材冰灯玉露松散型胚性愈伤组织为天津农学院园林植物实验室提供。

1.2 方 法

1.2.1 诱变材料的准备 选取生长正常的冰灯松散型胚性愈伤组织，在超净台中将其分成直径为0.5 cm的颗粒。将分割完的愈伤组织转移到含有滤纸与无菌水的培养皿中，放到25 ℃避光的环境下培养24 h，目的是消除其培养中激素对愈组织的影响。最后，将处理好的愈伤组织从培养室中取出备用。

1.2.2 采用浸泡法进行愈伤组织的离体诱变处理 将EMS用磷酸缓冲液（0.1 mol・L-1，pH值7.0）配制成不同浓度的溶液，采用抽滤灭菌的方法进行消毒处理。在超净台中将灭菌的EMS溶液分别加到100 mL无菌培养皿中。将事先准备的愈伤组织加到溶液中，每种浓度分别浸泡1，2，4 h，浸泡时间到达后，将愈伤组织从溶液中捞出，用无菌滤纸吸干EMS溶液后将其接种到事先配制好的MS固体培养基上进行培养。对照采用无菌水处理。愈伤组织培养条件为25 ℃，24 h连续光照，光照强度为2 000 lx。经过20 d的培养，对愈伤组织的生长情况进行观察统计。

1.2.3 采用培养基中添加诱变剂的方法进行化学诱变处理 将灭菌后的MS固体培养基在微波炉中融化，在培养基温度低于50 ℃时分别加入一定量的EMS溶液。EMS用磷酸缓冲液（0.1 mol・L-1，pH值7.0）配制成，采用抽滤灭菌的方法进行消毒处理。将含有不同浓度EMS的MS分装到灭菌的100 mL三角瓶中，每瓶加入30 mL培养基。待培养基凝固后，将事先准备的愈伤组织接种到培养基表面。将接种好的三角瓶放到培养室中进行培养。培养条件同前一步骤。培养时间设定3个，分别为2，4，8 d。其中每个三角瓶接种10块愈伤组织，每个处理重复5瓶。对照接种到MS培养基上。将处理后的愈伤组织再次接种到不添加EMS的MS培养基上，经过20 d的培养观察，记录统计愈伤组织的生长情况。

1.2.4 采用EMS进行冰灯玉露离体诱变 将冰灯玉露松散型胚性愈伤组织按照上一步骤筛选出的最佳诱变剂量及时间进行处理，经过处理后的愈伤组织在MS上进行培养。待到球形胚形成时，将其转移到MS+0.25 mg・L-1 BA的培养基上继续培养。经过大约2～3次继代，球形胚即可发育成为正常的植株。根据再生植株的生长情况，可以初步判断诱变后出现变异的效率。

2 结果与分析

2.1 浸泡法诱变处理效果

采用浸泡法处理愈伤组织进行诱变的操作很简单，但在浸泡时要注意愈伤组织团的大小，本试验中采用直径0.5 cm的大小，但所有愈伤组织为松散型的愈伤组织，因此在操作中很容易将愈伤组织团夹碎，所以在转移冰灯玉露愈伤组织时应十分小心。将经过浸泡处理的冰灯玉露愈伤组织转移到MS培养基上，并在培养室中培养20 d后，愈伤组织出现不同程度的变化，有的在转移的前2 d就出现了死亡，有的一直没有变化，具体情况经过统计并记录整理，结果见表1。

从表1可以看出，冰灯玉露愈伤组织在经过EMS溶液处理后会出现不同的变化。首先，在低浓度的EMS处理下或较短的处理时间后，大部分愈伤组织都可以正常生长，而且存活下来的愈伤组织基本都能够再生；其次，随着EMS浓度的增大和处理时间的延长，愈伤组织存活率呈现明显的下降，存活下来的愈伤组织不能再生，并且当培养时间超过30 d，所有存活下来的愈伤组织褐变死亡。从对照可以看出，部分愈伤组织在采用无菌水浸泡后也有少数死亡的现象，这可能是在转移愈伤组织块时，夹碎愈伤组织，导致愈伤组织块过小而死亡。由于EMS处理后部分存活下来的愈伤组织不能再生，因此，确定的半致死剂量失去了实际意义。本试验曾尝试采用较低浓度配合较长处理时间的方法，仍然不能确定准确的EMS处理条件，从而实现部分存活下来的愈伤组织再生。综上所述，采用浸泡法很难获得理想的半致死剂量。

2.2 培养基中添加诱变剂的处理效果

在采用浸泡法不能获得理想的诱变剂量和处理时间试验后，本研究又尝试了在培养基中加入低浓度EMS的方法，在处理一段时间后，将生长正常的愈伤组织转移到MS上，进行愈伤组织的再生培养。经过一段时间的再生培养后，可以获得一定数量的再生苗，具体情况见表2。

从表2的数据来看，EMS的不同浓度和不同处理时间对于冰灯玉露愈伤组织的存活率影响差异显著。首先，在低浓度的EMS或较短的处理时间的处理组合中，愈伤组织存活率较高，而且存活下来的愈伤组织都可以再生成苗；其次，随着EMS处理时间和处理浓度的增加，愈伤组织的存活率出现大幅度的下降，但再生率相比下降幅度不大。如在采用0.15%EMS处理4 d的试验组合中，愈伤组织的存活率已经下降到43%，但愈伤组织的再生率仍然保持88%，这与前一步骤的浸泡法结果不同。这也说明，可以采用这一方法来确定EMS的处理剂量与处理时间。因此根据本试验结果，在采用0.1%EMS浓度的培养基上进行诱变处理4 d可以获得接近半致死剂量的理想诱变值。

2.3 采用EMS进行冰灯玉露离体诱变效果

为了进一步证实采用在培养基中加入诱变剂进行冰灯玉露愈伤组织离体诱变的效果，本试验采用在MS培养基中加入0.1%浓度的EMS，将冰灯玉露愈伤组织接种到上面处理4 d，然后将其转移到MS培养基上，对存活下来的愈伤组织分别进行再生培养。通过观察这些存活下来的愈伤组织再生苗的形态特征，初步判断采用这一技术途径获得的诱变效率。具体试验结果见表3。

从表3可以看出，采用在培养基中加入EMS进行冰灯玉露愈伤组织诱变，存活下来的愈伤组织接近一半，而且这些愈伤组织基本可以再生成苗，这与前面的结果接近。从产生的表现型变异来看，变异率大约达到1.5%，虽然不能准确判断这些变异的可靠性，但与对照相比（对照在200块愈伤组织中没有发现表现型异常的）已经很高。这说明此方法对于采用愈伤组织为外植体进行化学诱变是可行的。但是，进一步判断变异的可靠性还需要进一步试验。

3 结论与讨论

3.1 浸泡法对于冰灯玉露愈伤组织诱变失败的原因分析

本研究采用浸泡法进行愈伤组织的化学诱变并不成功，分析其原因可概括为以下几个方面。第一，浸泡法一般要采用较高浓度的诱变剂，这样就会对愈伤组织产生较强的破坏作用，如果采用较低的浓度，就会因为浸泡时间过短而达不到诱变的效果，因此，对于有些不容易产生变异的植物品种来说不宜采用此种处理方式。在本试验中冰灯玉露就是不容易发生突变的植物品种，其品种特性一般不容易改变。第二，冰灯玉露的愈伤组织为松散型胚性愈伤组织，这种愈伤组织细胞间的间隙较大，容易被诱变剂进入，从而使得愈伤组织一直处于诱变剂的作用之下，虽然在试验中采用吸水纸将表面的诱变剂吸掉，但其内部还存留较多的诱变剂，从而造成持续诱变的效果。第三，采用浸泡法的时间一般不会很长，因为诱变剂的浓度较高，但较短时间下，植物细胞的分裂周期还没有完成，一些劣势突变很难在去掉诱变剂后继续进行，细胞会因其自我修复的机能得以恢复，因此，产生变异的可能性降低。而采用高浓度诱变剂也会导致愈伤组织毒害致死，因此，在采用浸泡法进行离体诱变时应谨慎采用。第四，浸泡法需要反复夹取愈伤组织块，对愈伤组织产生一定的物理伤害，因此，也会造成愈伤组织因损伤而死亡的现象，造成此方法的使用障碍。另外，浸泡法由于操作原因，容易污染，处理温度也需要反复试验才能准确采用，这些都增加了诱变的难度，从而导致诱变效果的下降。

3.2 在培养基中加入诱变剂进行离体诱变的特点

在培养基中加入诱变剂进行植物材料的离体诱变是浸泡法的一种替代，相比之下其主要存在以下几个优势。第一，在培养基中加入诱变剂的方法可以采用低浓度诱变剂进行化学诱变，这样不会造成对外植体的毒害作用，因为其作用时间长，低浓度诱变剂一样可以发挥效率。第二，培养基中营养及氧气充足，愈伤组织外植体在此环境下不会产生变化，不会影响其再生，从而提高诱变效率。第三，采用培养基中加入诱变剂进行化学诱变不会对外植体反复操作，减少了对愈伤组织破坏和污染的机会，从而提高诱变效率。第四，此方法可与筛选压力共同使用进行定向诱变，可以大大提高诱变效率。

虽然，在培养基中加入诱变剂的方法有很多优势，但也存在一些弱点：首先，诱变剂不能充分作用于整外植体，只有接触培养基的部分作用充分，这样会造成非突变体成为主要竞争对象，使得诱变效率下降，这可以通过在培养基中加入筛选压力进行定向诱变加以解决；其次，诱变剂在加入培养基中会受到培养基中化学成分的影响从而降低诱变效果；另外，在加入培养基时，培养基的温度对诱变剂也产生不利影响。总之，采用何种诱变方法应根据诱变材料和诱变目标的不同做出选择，并进行相应的调整。

参考文献：

[1]吴崇峰.多肉植物玉露的养护与繁殖[J].农村百事通，2014（22）：37-38.

[2]宋扬.冰灯玉露的组织培养与快速繁殖技术研究[J].现代农业科技，2014（18）：164， 166.

[3]兑宝峰.玉露的栽培繁殖[J].中国花卉园艺，2009（6）：34-35.

[4]张学云.紫花苜蓿耐盐材料的鉴定及胚状体耐盐性诱变研究[D].北京：中国农业科学院，2013.

[5]张学云，杨丽，范金，等.紫花苜蓿体细胞胚的辐射诱变及耐盐性筛选[J].中国草地学报，2015（3）：31-36.

[6]李淑平，严兴洪.60Co-γ射线辐照对长紫菜的诱变效果及优良品系分离与特性分析[J].海洋学报，2015（10）：69-79.

[7]苗博瑛，刘艳军，杨静慧.黑莓松散型胚性愈伤组织的诱导[J]. 山西农业科学，2014（3）：209-212，216.

[8]王月芳，奚元龄，魏振承，等.γ-射线和秋水仙素对兰州百合（Lilium davidii var.Willmottiae）体细胞诱变的效应[J].江苏农业学报，1989（2）：31-37.

[9]段益莉.冰灯玉露在内江的栽培与应用研究[J].内江科技，2016（4）：131-132.

[10]张景新，刘艳军，杨静慧，等.激素对冰灯玉露不定芽和不定根分化的影响[J].天津农林科技，2016（4）：4-6.