Hcy对人血管平滑肌细胞中microRNA―125b表达的影响

摘要：目的 探讨同型半胱氨酸（Hcy）对人血管平滑肌细胞中microRNA-125b表达的影响。方法 原代培养人脐静脉平滑肌细胞，分为空白对照组，Hcy干预组（50、100、200、500 μM）共计5组；MTT法检测细胞增殖活；荧光定量PCR（qRT-PCR）法检测各组VSMCs中miR-125b的表达。结果 MTT法显示Hcy 可以明显促进VSMCs增殖（P

关键词：同型半胱氨酸；microRNA；血管平滑肌细胞；动脉粥样硬化

中图分类号：R543.1+2 文献标识码：A

动脉粥样硬化（Atherosclerosis， AS）所致的心脑血管疾病是当今严重危害人类生命健康的疾病之一。血管平滑肌细胞（Vascular smooth muscle cells， VSMCs）的活化、增殖、浸润功能的改变是AS形成的中心环节。大量研究表明同型半胱氨酸（Homocysteine， Hcy）是AS的独立危险因子[1]，而研究显示Hcy可以明显促进VSMCs的增殖[2]。miR-125b是动脉平滑肌细胞主要表达的microRNA之一[3]。研究表明，miR-125b的表达在正常组织与AS病理组织中存在显著差异，但是Hcy是否对miR-125b存在影响以及存在何种影响目前未见报道。因此，本研究拟培养原代血管平滑肌细胞，给予不同浓度的Hcy干预后，检测其对VSMCs的增殖活性，并检测miR-125b的表达，明确Hcy对miR-125b表达的影响，为进一步揭示Hcy在动脉粥样硬化中的作用提供理论基础。

1资料与方法

1.1一般资料 人主动脉平滑肌细胞株购自美国ATCC公司；DMEM/F-12培养基、胎牛血清购自美国Gibco公司；胰蛋白酶购自美国Sino-America Biotech；同型半胱氨酸、MTT购自美国Sigma-Aldrich；miRNA提取试剂盒、逆转录试剂盒及检测试剂盒购自北京天根；荧光定量PCR仪购自美国BIO-RAD公司。

1.2方法

1.2.1人主动脉平滑肌细胞培养 培养液为含 10%胎牛血清 青霉素100 U/ml 链霉素100 g/ml 的 DMEM/F-12培养基， 置于37℃ 饱和湿度 5% CO2 培养箱培养。

1.2.2 MTT检测VSMCs增殖活性 将VSMCs消化后，以每孔103～104的密度接种到96孔培养板中，每孔终体积为200 μl。继续培养待细胞进入对数生长期后，避光条件下每孔加入MTT 20 μl，37℃继续孵育4 h后，小心吸弃孔内的培养液。每孔加入100 μl DMSO，振荡10 min。每组设6个复孔。利用酶标仪在490nm波长下测定各孔吸光度值，记录并分析结果。

1.2.3荧光定量PCR检测miR-125b的表达 按照试剂盒说明书提取总miRNA，之后逆转录为cDNA，以此为模板进行荧光定量PCR检测miR-125b的表达；miR-125b引物序列：上游5'-GGGTCCCTGAGACCCTAACTTGT-3'，下游5'-GCTGTCAACATACGCT ACGTA-3'，扩增产物78 bp；反应条件：94℃预变性3 min，94℃ 变性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸30 s，35 次循环。以U6为内参照，根据PCR仪自动生成的Ct值，根据公式计算目的基因的相对量：相对表达量=2-Ct。

1.3统计学处理 结果以（x±s）表示。应用SPSS 11.0统计学软件进行统计学分析，采用One-way ANOVA进行多样本均数间比较，以P

2结果

2.1 Hcy对VSMCs增殖的影响 MTT结果显示不同浓度Hcy干预VSMCs后，Hcy可以明显促进VSMCs细胞的增殖活性，但并不呈剂量依赖关系，但并不是剂量依赖关系，在100 μM Hcy处作用最明显，与对照组比较差异有统计学意义（P

2.2 Hcy对miR-125b的表达的影响 qRT-PCR法检测各组VSMCs中miR-125b的表达，结果显示，Hcy可以明显抑制miR-125b的表达，但并不呈剂量依赖关系，在100 μM Hcy处作用最明显，与对照组比较差异有统计学意义（P

3讨论

microRNAs（miRNAs）在生物体基因调控中发挥了重要作用，主要通过转录后水平发挥基因沉默效应。miRNA虽然大约只占人类预测基因的3%以上，但却调控大约30%的蛋白编码基因，涉及细胞的增殖、分化等。不同组织和细胞具有特异性的miRNAs，比如miR-142和miR-223在造血系统特异性表达，miR-1、miR-30c和miR-26等在心肌细胞异表达[4]；而动脉血管平滑肌细胞主要表达的miRNA为miR-125b 、miR-145及miR-143 等[3]。miR-125b不仅在正常组织不同部位表达不同，在正常组织与病理组织中miRNAs的表达也存在明显差异，Tatsuguchi M等首次在大鼠颈动脉球囊损伤模型中发现miR-125b等表达下调[5]；Ruirui Ji等利用基因芯片的技术检测了颈动脉泡沫样损伤大鼠模型颈动脉中microRNA的差异表达，也发现miR-125b的含量下调[6]，这些都提示miR-125b通过参与VSMCs的生物学进程影响了AS的发生发展。而本课题研究发现，在Hcy干预下的VSMCs中，miR-125b低表达，提示Hcy通过影响Hcy的表达参与了VSMCs的增殖过程。此过程并不是剂量依赖关系，对此，我们分析可能的原因是：过高浓度的Hcy导致了其他的反应，如氧化应激、内质网应激、炎症反应等，这些反应导致了VSMCs的损伤而失去其正常状态；或者是Hcy导致的这些反应因为Hcy浓度的过高而超出了VSMCs自我修复的范围，打破了损伤与修复的平衡，从而导致了以上结果的发生，也提示有更生层次的机制存在。

综上所述，本课题首次发现在Hcy导致AS的发生发展过程中，其可能是通过影响miR-125b的表达促进了VSMCs增殖。

参考文献：

[1]Sobczak AJ. The effects of tobacco smoke on the homocysteine level--a risk factor of atherosclerosis[J].Addict Biol，2003，8（2）：147-158.

[2]Tang L， Mamotte CDS， Van Bockxmeer FM， et al. The effect of homocysteine on DNA synthesis in cultured human vascular smooth muscle[J].Atherosclerosis，1998，136：169-173.

[3]Sébastien S. Hébert. Putative Role of MicroRNA-Regulated Pathways in Comorbid Neurological and Cardiovascular Disorders[J].Cardiovasc Psychiatry Neurol，2009，24（34）： 5848-5856.

[4]Marilena V Iorio Carlo M Croce. MicroRNAs in Cancer： Small Molecules with a Huge Impact[J].J Clin Oncol，2009，27（34）： 5848-5856.

[5]Tatsuguchi M， Seok HY， Callis TE， et al. Expression of microRNAs is dynamically regulated during cardiomyocyte hypertrophy[J].J Mol Cell Cardiol， 2007， 42（6）：1137-1141.

[6]Ruirui Ji， Cheng Y， Yue J， et al. MicroRNA expression signature and antisense-mediated depletion reveal an essential role of microRNA in vascular neointimal lesion formation[J].Circ Res，2007，100：1579-1588.