“类风关巴布剂”穴位贴敷对CIA大鼠滑膜细胞凋亡及其分泌的TNF-αIL-1β的影响

【前言】“类风关巴布剂”穴位贴敷对CIA大鼠滑膜细胞凋亡及其分泌的TNF-αIL-1β的影响由文秘帮小编整理而成，但愿对你的学习工作带来帮助。YE Tianshen1,ZHOU Xianfei2, CHEN Yong1,ZHU XiaoChun1,LIN Xiangyang1, YANG Kaiyan1,FANG Jianqiao3 (1.The First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College, Wenzhou 325000,Zhejiang,China; 2.Wenzhou Medical College,Wenzhou 325000,Zhejiang,China; 3....

摘 要：目的：比较不同组合穴位贴敷“类风关巴布剂”对CIA大鼠滑膜细胞凋亡的影响。方法：大鼠背部5处皮内注射牛Ⅱ型胶原诱导的关节炎模型（CIA），观察以雷公藤为主的中药“类风关巴布剂”不同组合穴位贴敷对模型大鼠关节炎指数、电镜凋亡计分、免疫组化指标P53、bcl-2、NF-κβ计分，以及滑膜细胞上清液的白细胞介素-1β（IL-1β）与肿瘤坏死因子（tnf-α）的浓度变化的影响。结果：造模后大鼠关节炎指数明显升高、滑膜细胞凋亡抑制、各炎症指标升高；治疗后各穴位贴敷组大鼠的关节炎指数均有显著降低，凋亡计分、P53、bcl-2计分较模型组增加，NF-κβ计分、il-1β、TNF-α浓度降低，其中系统组（远近配穴）最接近正常组。结论： “类风关巴布剂”穴位贴敷能够有效控制cia大鼠关节炎的病情并诱导滑膜细胞凋亡，其机制可能是上调凋亡相关基因的表达及调节相关细胞因子和炎症介质等；远近配穴可能通过标本兼治，多靶点起效，使其整体疗效优于单纯远道取穴或局部取穴。

关键词：类风湿；关节炎；大鼠；细胞凋亡；穴位贴敷；雷公藤

中图分类号：R244.9文献标识码：A

文章编号：1673-7717(2008)05-0987-05

Effect of Rheumatoid Arthritis Cata-plasma Acupoint Application on CIA Rats Synovial Cell Apoptosis and Secreted TNF-α IL-1β

YE Tianshen1,ZHOU Xianfei2, CHEN Yong1,ZHU XiaoChun1,LIN Xiangyang1, YANG Kaiyan1,FANG Jianqiao3

(1.The First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College, Wenzhou 325000,Zhejiang,China;

2.Wenzhou Medical College,Wenzhou 325000,Zhejiang,China;

3.Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou 310009,Zhejiang,China)

Abstract:Objective:A comparison of the therapeutic effects of different acupoint combination with "Rheumatoid Arthritis Cata-plasma" on CIA rats synovial cell apoptosis.Methods: Induced Arthritis Rats’ back were endermic injected with type Ⅱ cattle collogen as animal models. There are five groups for comparison. Arthritis index (AI),electron microscope Apoptosis scores,immunity index P53 bcl-2,NF-κβ scores, and the concentration of interleukin-1β（IL-1β）and tumor necrosis factor（TNF-α）of synovial cell clear supernatant liquid were observed.

Results:Arthritis index (AI),synovial cell apoptosis inhibition and inflammation index in therapy groups were showed more difference than the control group. The systematic selection of acupoints is the best.There was also obvious difference between treatment group and model group in Arthritis index,apoptosis scores, bcl-2 scores,P53,NF-κβ scores,the IL1-β concentration and the TNF-αconcentration. The systematic selection of acupoints is the most effective among all.

Conclusion: "Rheumatoid Arthritis Cata-plasma"can effectually control the pathogenetic condition of the CIA rats and induce synovial cell apoptosis.The mechanism of the treatment probably is up-regulation the express of apoptosis related gene and adjust correlated cell factor and mediators of inflammation. Therapeutic effect of distant and near coordination of acupoints is better than distant selection or local selection of acupoints,that probably is because treating appearance and substance simultaneously, multitarget effect.

Keywords:Rheumatoid;arthrositis;rat;apoptosis;Sticking apply on acupoint;Tripterygium wilfordii

通讯作者：方剑乔，男，教授，博士研究生导师，研究方向：风湿病针刺镇痛。

类风湿关节炎(RA)是常见的严重危害人类身心健康的自身免疫性疾病。迄今为止，其发病机制仍不十分清楚，关节滑膜的过度增生是其主要病理改变。本实验通过给胶原诱导的关节炎（CIA）大鼠不同组合穴位贴敷以雷公藤为主的复方中草药制剂――“类风关巴布剂”，观察其对大鼠滑膜细胞凋亡的影响，并初步探讨经络腧穴在其中的作用。

1材料与方法

1.1动物模别及分组

Wistar大鼠，雄性，90只，体重120～160g，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司。适应性喂养7天后。随机选出 10只为正常对照组(正常组)。其余80只参照《药理学实验指南――新药发现和药理学评价》”[1]及相关文献方法造模。具体方法为：在无菌条件下，用0.1mol／L冰醋酸充分溶解牛Ⅱ型胶原(BcⅡ)，浓度为4mg/mL，置4℃冰箱过夜后，与弗氏完全佐剂等体积混合、振荡乳化，制成BcⅡ乳剂(即每0.5mL含1mg BcⅡ)。置4℃冰箱保存备用。注射方法：于大鼠颈、背部5个部位行皮内注射总量0.5mL，含1mg BcⅡ型胶原。第21天后同法0.3mL加强注射。于首次注射BcⅡ乳剂后30天筛选出关节炎指数3分以上，单侧后足外踝以下隆起的体积1.6mL以上的发病鼠40只，按关节炎指数随机分为4组：类风关巴布剂局部贴敷组(局部组)、类风关巴布剂远道穴位贴敷组(远道组)、类风关巴布剂远近配穴贴敷组(系统组)和模型对照组(模型组)各10只。正常对照组(正常组)用生理盐水同法注射。

1.2药物配制及给药方法

1.2.1类风关巴布剂的组成及制作方法 雷公藤、白花蛇、乳香、没药等，共12味，按固定剂量配伍（其中雷公藤占总药量的28%），晒干，研粉，过20目筛，用80%乙醇渗漉提取，然后过滤取液，经低温低压（50℃，-0.8个大气压）蒸馏去乙醇后得浸膏，将浸膏按一定比例加入事先配制的巴布剂基质（主要成份：明胶、甘油、聚丙烯酸钠等）中，并加入0.5％的促渗剂（氮酮），一定比例的乳化剂及防腐剂等，充分溶合，均匀涂布于无纺布上，覆盖聚乙烯薄膜，切成3cm×3cm的方块（重量１g），密封包装，阴凉处储存备用。

1.2.2给药方法 根据临床及有关动物实验的取穴方案[2]取穴。系统组：“大椎”、双侧“肾俞”、双侧“太溪”，共5个穴点；远道取穴组：“大椎”、双侧“肾俞”，共3个穴点；局部取穴组：双侧“太溪”，共2个穴点。根据贴敷总面积相同(剂量相等)的原则，系统组每穴贴敷面积为0.15cm2的圆形巴布剂(半径0.22cm)；远道组每穴贴敷面积为0.25cm2(半径0.28cm)；局部组每穴贴敷面积为0.375cm2(半径0.35cm)。在穴位处脱毛后贴敷，每3天1次，共5次，每次雷公藤甲素剂量约为3.8μg[3]。正常组和模型组模仿局部组贴敷不含药物的巴布剂基质。15天后各组同时处死取标本。

1.3主要及试剂

仪器：显微镜OLYMPUS（日本），低温高速离心机 BECKMEN（美国），透射电镜 H7500 （日本）,酶标仪Bio-rad680（美国）。试剂：牛Ⅱ型胶原chondrex公司（美国），完全弗氏佐剂sigma公司（美国），IL-1β（白介素）试剂盒 biosource公司（美国），TNF-α（肿瘤坏死因子）试剂盒 biosource公司（美国），免疫组化试剂购于福建迈新生物技术开发有限公司（bcl-2） 1.5mL，NF-Kappa B/p50 1.5mL，P53 protein（DO-7）1.5mL，聚赖氨酸玻100片，EiVision+PolymerHRP(Ms/Rb) IHC Kit 6mL。

1.4标本采集及处理

1.4.1滑膜组织采集[4] 于给药15天后，全部动物用2％戊巴比妥钠腹腔麻醉，腹主动脉采血。仰位固定，沿后肢膝关节正中纵行切外皮肤直至暴露出以膝关节为中心约3cm×3cm的区域，可见髌骨下极向下延续有一层平滑光亮呈浅淡黄色的滑膜组织。用眼科直镊钝性分离关节囊的滑膜层和纤维层，完整剥离滑膜组织，最后以眼科镊轻轻夹住其中央，用眼科剪完整剪下滑膜组织约100mg。同法采集另一侧膝关节滑膜组织。

1.4.2 电镜标本制备 用简单随机法抽取各组大鼠一侧滑膜，用消毒的剃须刀轻轻切取约2mm×2mm×2mm的滑膜组织，固定于2.5%戊二醛中，过夜，磷酸缓冲液漂洗，1%锇酸后固定，再磷酸缓冲液漂洗，然后按50%、70%、80%、90%、95%、100%的乙醇系列脱水，再100%丙酮脱水。用spurr包埋剂与丙酮按1∶1(1h)，3∶1(3h)，纯spurr包埋剂(过夜)渗透。70℃聚合8h。超薄切片，用醋酸双氧铀染色，漂洗干净，然后柠檬酸铅染色，漂洗干净，最后透射电子显微镜观察。

1.4.3滑膜细胞上清液的制备[5] 将剩余滑膜组织充分剪碎，用含有5mg/L LPS的RPMI 1640培养液配制滑膜细胞悬液(1×109/L),加至24孔培养板,每孔1mL,于37℃,5%CO2培养箱中培养48h,收集上清液,-20℃保存作细胞因子检测。

1.4.4免疫组织化学标本的制备 将另一侧滑膜用4％多聚甲醛固定，常规脱水，石蜡包埋，5μm切片，分别进行与凋亡相关的P53蛋白、bcl-2和核转录因子（NF-κβ）的免疫组织化学法染色。免疫组织化学检测P53等的操作过程[6]：（1） 石蜡切片脱蜡和水化后，用PBS（pH7.4）冲洗3次，每次3min（3×3）。(2)根据每一种抗体的要求，对组织抗原进行相反的修复(采用柠檬酸修复)。(3)如有必要，每张切片加1滴或50μL 3%过氧化氢溶液，室温下孵育10min，以阻断内源性过氧化物酶。PBS冲洗3×3。(4)甩去PBS，每张切片加1滴或50μL的第一抗体（用户自选），室温下孵育60min或4℃过夜，建议阅读每种抗体的说明书。(5)PBS冲冼3×5。(6)甩去PBS液，每张切片加1滴或50μL聚合物增强剂（试剂A），室温下孵育20min。(7)PBS冲洗3×3。(8)甩去PBS液，每张切片加1滴或50μL酶标抗鼠/兔聚合物（试剂B），室温下孵育30min。(9)PBS冲洗3×3。(10)甩去PBS液，每张切片加2滴或100μL新鲜配制的DAB或AEC显色液，显微镜下观察3～10min，阳性显色为棕色或红色。(11)蒸馏水或自来水冲洗，苏木素复染，0.1%盐酸分化，自来水冲洗，PBS冲洗返蓝。 (12)如果用DAB显色，则切片经过梯度酒精脱水干燥，（二甲苯透明）中性树胶封片；如果用AEC显色，则切片不能经酒精脱水，而直接用水性封片剂封片。

1.5观测指标

1.5.1关节炎指数评分方法 参照文献［1]方法：0分：无红肿；1分：趾关节稍肿，足爪或足垫单个区域炎症；2分：关节轻度红肿，足爪和足垫或踝关节2个区域以上的炎症；3分：关节中度红肿，轻度功能障碍；4分：关节重度红肿，僵直甚至畸形，严重功能障碍。

1.5.2细胞凋亡计分[6] 用透射电镜观察，滑膜组织中的凋亡细胞体积缩小，形态不规则，表面微绒毛消失，双层核膜清晰，核固缩，染色质浓聚，胞质少量溶酶体，粗面内质网、线粒体肿胀，空泡变性，游离核糖体发达；或电镜下见滑膜细胞呈梭形，细胞膜皱缩，细胞体积变小，与邻近细胞分离，核内见染色质浓缩，集于核膜下，可见凋亡小体形成，胞质内见线粒体和溶酶体等结构完整，线粒体有空泡改变，根据这些细胞改变的特征被认定为早期阶段的凋亡细胞（见图1），每张切片沿滑膜组织带计算400倍视野中细胞的凋亡数，计数 5～10个视野，标出每个视野平均细胞凋亡数。

1.5.3P53 bcl-2 NF-κβ计分[6] 在滑膜组织中肿瘤抑制基因P53蛋白（P53）、原癌基因（bcl-2）、转录因子核因子-κβ（Nuclear factor-κβ，NF-κβ）表达阳性的滑膜组织细胞核呈橘黄色或棕黄色（见图2），每张切片沿滑膜组织带计算400倍视野中阳性细胞的占有率，计数3个视野，标出每个视野平均阳性细胞占有率，并按阳性细胞占有率分为5级：0：无阳性细胞，+：阳性细胞0～25%，++：阳性细胞25%～50%，+++：阳性细胞 50%～75%，++++：阳性细胞 75%～100%。0级定积分为0，+积分为1，以此类推。

1.5.4凋亡相关细胞因子肿瘤坏死因子（TNF-α） 白细胞介素1β（IL-1β）的检测 按照试剂盒说明，以酶联免疫吸附法(ELISA)测定滑膜浸液的TNF-α、IL-1β浓度。

1.6统计学分析

统计学软件用SPSS11.0统计方法，若数据为正态分布总体比较采用多组单因素方差分析，组间比较用q检验(Newman-Keuls法)，否则用秩和检验的Kruskal-Wallis法和Nemenyi法，P

2结 果

2.1关节炎指数积分比较

在表1中，治疗前各组关节炎指数差异无显著性，治疗后与模型组比较有非常显著差异（P

2.2电镜凋亡积分比较

由表2可见，各治疗组与模型组比较差异有显著性，治疗后滑膜细胞凋亡增加，而系统组接近正常组（P>0.05）。

2.3P53 bcl-2 NF-κβ计分比较

在表2中，与模型组比较，各治疗组的P53、bcl-2、NF-κβ积分差异均有显著性，P53和bcl-2积分增加，说明治疗后滑膜细胞凋亡增加，而系统组接近正常组（P>0.05）；NF-κβ积分降低，说明炎症改善，此项指标也是系统组接近正常组。

2.4关节浸液的TNF-α IL-1β水平比较

在表3中，与模型组比较，各治疗组的TNF-α水平下降非常显著（P

3讨 论

细胞凋亡是一种由基因控制的细胞自主性死亡方式，对于维持组织器官的形态及机体正常的生理功能有着重要的意义，细胞增生和凋亡的相对平衡的破坏常导致疾病的发生。目前认为RA关节软骨和骨组织的损害主要是由于滑膜细胞的活化和增生而引起的，滑膜细胞过度增生源于滑膜细胞凋亡的相对不足。

RA病人滑膜细胞存在细胞凋亡过程的异常。这些异常与p53、Fas、FasL、Bax、Bcl-2等表达异常及体内其他调节因素(如细胞因子等)有关。最近研究表明[7]，RA滑膜细胞p53蛋白存在过度表达，并证实p53蛋白是滑膜细胞凋亡的重要调节剂，p53蛋白表达异常导致RA滑膜衬里层细胞增生和关节损害；Bcl-2是一种抑制细胞凋亡的原癌基因，有研究认为[8]Bcl-2在RA滑膜衬里层细胞中呈高表达可导致凋亡障碍，并与细胞增值相关。

IL-1β前体由滑膜组织的单核细胞或滑膜细胞所分泌，并在细胞内由ICE(IL-1β转化酶)水解为IL-1β，具有较强的致炎作用，有实验表明它参与了RA的滑膜病变，它能刺激IL-6、IL-8和VEGF的分泌，IL-1与其I型受体相结合，触发MAPKs级联，导致NF-κβ移至核内。另据研究IL-1β以剂量依赖方式抑制滑膜细胞fas的表达，即抑制凋亡[9]。

TNF-α对RA滑膜细胞凋亡也有重要影响，它不仅直接引起滑膜细胞的增殖，还可刺激IL-2及TNF-α本身的分泌，进一步引起滑膜细胞的增生。近来研究发现，TNF-α过量表达可减少RA关节内Fas介导的细胞凋亡，继而有助于滑膜细胞的增殖[10]。

NF-κβ普遍存在于真核细胞，能与多种基因的启动子或增强子上的特异性位点结合并促进基因转录的一类蛋白质的总称。NF-κβ通过调节许多细胞因子、趋化因子、生长因子、黏附分子及多种酶的基因表达，参与机体免疫调节和炎症反应，并在细胞增殖、分化及凋亡方面起关键作用。NF-κβ与RA的相关研究成为热点之一。研究[11]证明NF-κβ与血管翳生成、关节软骨侵蚀密切相关。NF-κβ活性明显升高的结果是多种炎性因子、趋化因子、生长因子、黏附分子、受体及酶等物质生成相应增多，而在前炎性细胞因子TNF-α和IL-1介导的NF-κβ异常活化中，NF-κβ起主要的调控作用。

总之以上指标相互作用，密切联系，较全面地反映了RA滑膜细胞凋亡、炎症病理过程，因此，本实验对以上凋亡相关指标进行了免疫组织化学检测，还检测了滑膜细胞培养上清液的IL-1β和 TNF-α水平。同时增加了凋亡检测公认为最重要的指标电镜及有效反映关节炎症情况的关节炎指数。

胶原诱导的关节炎（CIA）的产生和发展与RA有着很多的相似性，二者都依赖于自身反应性T细胞和B细胞的激活，并能产生类似类风湿因子的抗体。本实验选用CIA大鼠为模型。在CIA模型中，滑膜细胞增生活跃的起点应在针对CⅡ的自身反应性T细胞和B细胞激活之后，具体时段可能在首次胶原皮内注射后10～20天或更长，文献报道[12]滑膜明显增生持续在首次注射胶原后3～8周，因此，本实验选择了该时间段。

RA属于中医学痹证范畴，近年来，有报道中医药、针灸[13]能够诱导过度增生的RA滑膜细胞凋亡。并有采用含雷公藤的复方中药穴位贴敷治疗CIA大鼠的研究[14]。笔者将以雷公藤为主药的复方中药制剂与针灸穴位有机结合，研制类风关巴布剂进行了药毒理、制剂学及临床的研究，在大鼠佐剂性关节炎穴位贴敷研究中[15]，证明相同的给药剂量（贴敷面积）不同的穴位组合，作用有差异，以系统组（远近配穴）最佳。据检测每1g类风关巴布剂含雷公藤甲素1.71mg[2]。雷公藤甲素体外给药研究[4]发现其主要作用于S期的滑膜细胞，既只能诱导已活化T细胞发生凋亡，而不能造成静止期的T细胞发生凋亡；另据研究[16]雷公藤甲素还对CIA大鼠滑膜细胞产生的TNF-α和NF-κβ等有显著抑制作用。

本实验采用四肢关节肿胀计分法（关节炎指数）评价动物四肢的关节炎症，与以前的结果[15]相似，治疗后各穴位贴敷组与模型组比较均有明显改善（P

今后的研究目标，从微观看，要从分子生物学的角度（如基因、信号转导机制等）深入研究作用的主要机理；从宏观看，应该进一步优选药物和穴位处方，以达到最佳疗效。

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