HPLC法测定红牛饮料中咖啡因、烟酰胺、盐酸吡哆辛的含量

【摘 要】目的：建立高效液相色谱法测定红牛饮料中咖啡因、烟酰胺、盐酸吡哆辛含量的方法。方法：选用HPC18柱（4.6×250mm），流动相：癸烷磺酸钠溶液（0.14%）-乙腈-磷酸（800：200：1），检测波长为280nm对其进行含量测定。结果：咖啡因在7.092μg～141.84μg范围内呈良好的线性关系，回归方程为Y=25558X+9848.7，r=0.9998；烟酰胺在4.55μg～90.99μg范围内呈良好的线性关系，回归方程为Y=1816.1X-220.24； r=0.9993；盐酸吡哆辛在1.026μg～20.52μg范围内呈良好的线性关系，回归方程为Y=17924X-2342.6，r=0.9999。结论：本法简便、可靠，可作为红牛饮料中咖啡因、烟酰胺、盐酸吡哆辛的含量测定方法。

【关键词】HPLC法；咖啡因；烟酰胺；盐酸吡哆辛；含量测定

【中图分类号】R427 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2012）13-0043-02

有些食品为了改善食品色、香、味等品质，通常使用食品添加剂。红牛饮料中含有咖啡因、烟酰胺、盐酸吡哆辛等成份，其中咖啡因具有提神醒脑等刺激中枢神经作用，且易上瘾，故而建立咖啡因等成份的含量测定方法十分必要，笔者研究建立了红牛饮料中的咖啡因、烟酰胺、盐酸吡哆辛等三个成份的含量测定方法，现报道如下。

1 仪器与试药

1.1仪器：岛津LC-20泵， CBM-20A型控制器，SPD-20A型检测器，LC-Solution色谱工作站。万分之一电子分析天平（AEL-200）。

1.2试剂与试药： 咖啡因对照品（批号：1215-9503 ）中国药品生物制品检定所；烟酰胺对照品（批号：100115-200703 含量99.9%）中国药品生物制品检定所；盐酸吡哆辛对照品（批号：100116-200502 ）中国药品生物制品检定所；色谱甲醇，纯化水，其他试剂均为分析纯。红牛饮料均采购于吉首市某商店，共计3批。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

2.1.1 色谱柱：色谱柱填充剂为十八烷基键合硅胶，本实验研究采用C18柱（4.6×250mm），流动相：癸烷磺酸钠溶液（0.14%）-乙腈-磷酸（800：200：1），流速：1.0ml/min；检测波长为280nm；理论塔板数按咖啡因峰计不得低于4000，相邻色谱峰之间的分离度应符合要求。

2.1.2 供试品溶液的制备：精取样品10.00ml，置20ml容量瓶中，加甲醇：水：磷酸（100：400：0.5）的混合溶液稀释至刻度，摇匀，经0.45μm的滤膜过滤，待测。

2.1.3 对照品溶液的制备；分别精密称取咖啡因、烟酰胺、盐酸吡哆辛对照品适量，用甲醇：水：磷酸（100：400：0.5）的混合溶液稀释制成每1ml含0.14mg咖啡因、0.1mg烟酰胺、0.02mg盐酸吡哆辛的溶液，即得。

2.1.4 阴性对照试验：按2.1.2 与 2.1.3项下的方法制备供试品溶液和对照品溶液。分别精密吸取甲醇：水：磷酸（100：400：0.5）的混合空白溶液、对照品溶液、供试品溶液各10μl，分别注入高效液相色谱仪，测得结果为：空白溶液的图谱中在与三个对照品以及供试品色谱图相对应的保留时间处无色谱峰出现，表明该含量测定方法专属性好，空白溶剂无干扰。（色谱图见图1 、2 、3）。

2.1.5 线性关系考察：精密称取咖啡因对照品17.73mg、烟酰胺对照品30.36 mg、盐酸吡哆辛对照品25.66 mg，分别置50ml、20ml、25ml容量瓶中，用甲醇：水：磷酸（100：400：0.5）的混合溶液稀释至刻度，摇匀，精取上述咖啡因对照溶液20.00ml、烟酰胺对照溶液3.00ml、盐酸吡哆辛对照溶液1.00ml置同一个50ml容量瓶中，用甲醇：水：磷酸（100：400：0.5）的混合溶液稀释至刻度，摇匀，即得。（咖啡因的浓度为 141.84μg/ml、烟酰胺的浓度为90.99μg/ml、盐酸吡哆辛的浓度为20.52μg/ml），精取上述混合标准溶液1.0 ml分别置1.0 ml、 2.0 ml 、5.0 ml 、10.0 ml、20.0 ml容量瓶中，用甲醇：水：磷酸（100：400：0.5）的混合溶液稀释至刻度。按上述色谱条件测定；以峰面积为纵坐标（Y），浓度为横坐标（X）做线性回归，咖啡因的回归方程为Y=25558X+9848.7；r=0.9998；烟酰胺的回归方程为Y=1816.1X-220.24；r=0.9993；盐酸吡哆辛的回归方程为Y=17924X-2342.6； r=0.9999；结果表明咖啡因在7.092μg～141.84μg、烟酰胺在4.55μg～90.99μg、盐酸吡哆辛在1.026μg～20.52μg范围内呈良好的线性关系。

2.1.6 稳定性试验：取同一份供试品溶液，分别在0、1、2、4、8、12h进行测定，结果表明咖啡因在12h内的面积积分值基本稳定不变，RSD为0.064 %，烟酰胺在12h内的面积积分值基本稳定不变，RSD为1.17%；盐酸吡哆辛在12h内的面积积分值基本稳定不变，RSD为1.20%。

2.1.7 重复性试验：取同一批样品6份，各精取10.0ml，测定每份样品含量，按回归方程计算含量，结果咖啡因平均含量187μg/ml，RSD为0.10%；烟酰胺平均含量为47μg/ml，RSD为 0.93 %；盐酸吡哆辛平均含量为4.6μg/ml，RSD为0.70 %。

2.1.8 加样回收试验：取供试品6份，分别依次加入咖啡因、烟酰胺、盐酸吡哆辛对照品溶液适量，按供试品溶液的制备方法制备样品溶液，同法操作，分别注入高效液相色谱仪测定含量，计算回收率，结果回收率为：咖啡咽96.2%，RSD为0.69%；烟酰胺96.7%，RSD为0.92%；盐酸吡哆辛101.3%，RSD为1.4%。

2.1.9 样品含量测定：分别取供试品2份，测定结果分别为：咖啡因185.8μg/ml，烟酰胺45.8μg/ml，4.6μg/ml。

3 讨论

检测波长的选择：取含咖啡因、烟酰胺、盐酸吡哆辛三者的混合对照溶液，通过岛津SPD-20A型二极管阵列检测器在200nm～400nm波长范围扫描，结果三者均在280nm处有最大吸收，故选择280nm作为检测波长。本法简便、可靠，可作为红牛饮料中咖啡因、烟酰胺、盐酸吡哆辛的含量测定方法。

作者简介：

徐玉辉，女，副主任药师，药品食品检验