柠檬酸水溶液生物亲和萃取高效液相色谱法检测鱼肉样品中喹诺酮类药物残留

[HT][HK40][HT5”H]摘要[HTSS]用瑞利散射光谱法研究了鱼血清蛋白在不同浓度有机弱酸水溶液中的变性情况，并结合液相色谱法讨论了鱼肉样品中主要基体蛋白质与鱼油对喹诺酮类药物（QNs）残留提取的影响。研究表明， 0.5 mol/L柠檬酸水溶液可引起蛋白质缓慢且完全变性，导致蛋白质与QNs络合物离解，释放结合的药物。本研究以柠檬酸水溶液为生物亲和提取液，发展了一种高效样品前处理方法，结合高效液相色谱法测定了鱼肉中QNs残留。样品前处理过程为：称取适量匀浆后的鱼肉样品于聚四氟乙烯管中，以0.5 mol/L柠檬酸水溶液提取QNs残留2次，分别取2 mL提取液加入PSA和Cleanert NH2 混合颗粒吸附剂进行净化。本方法用于测定鱼肉样品中的依诺沙星、诺氟沙星、环丙沙星、洛美沙星、恩诺沙星和加替沙星，回收率为82.0%～95.2%，RSD为1.9%～5.8%，检出限为0.0055～0.016 mg/kg。方法步骤简单、快速、可靠、环境友好。

1引言

喹诺酮类药物（Quinolones，QNs） 是一类人工合成的抗菌药，其中最为常见的是依诺沙星（Enoxacin，ENX），诺氟沙星（Norfloxacin，NOR），环丙沙星（Ciprofloxacin，CIP），洛美沙星（Lomefloxacin，LOM），恩诺沙星（Enrofloxacin，ENR）和加替沙星（Gatifloxacin，GAT）等。QNs具有低廉的价格和良好的广谱抗菌性，被广泛应用于水产养殖。然而，QNs在水产品中的过量残留会引起食用者肠道菌群失衡，甚至癌变，从而威胁人类健康[1]。世界食品法典委员会和世界各国对水产品中QNs残留均有严格的限量要求，国际贸易中也对其限量有严格规定。因此，QNs的残留检测尤为重要。

水产品中含有大量蛋白质、脂肪等复杂基体，因此，水产品中QNs残留检测的关键是样品前处理。目前，有关动物组织样品中QNs残留检测的样品前处理方法报道较多[2～7]，所涉及的方法主要为药物残留提取、固相萃取（SPE）净化两个步骤，提取液一般为可以沉淀蛋白质的乙腈与酸（包括三氯乙酸、盐酸、甲酸等）混合溶液。这些方法的缺点是耗用大量的有机溶剂， 样品前处理步骤多， 提取液净化复杂，极易造成残留药物的损失。Stubbings

等以乙腈为提取液，以固相分散萃取（DSPE）技术简化了样品净化步骤，但仍然需要使用乙腈作为溶剂[8]。

本课题组在研究水产品中农药残留检测的前处理方法中，发现蛋白质基体与药物的结合作用影响水产品中药物残留的提取效率[9～11]。已有研究表明，QNs与蛋白质有较强的结合作用[12，13]，这会降低QNs残留的萃取效率。传统提取方法中乙腈与酸的混合液作为提取液时，蛋白质发生快速沉淀，引起药物包裹损失。弱酸水溶液也可以使蛋白质发生变性、沉淀，但作为QNs残留提取剂尚未见文献报道。本研究选择合适浓度的柠檬酸水溶液作为QNs残留提取剂，使蛋白质完全变性，离解与其结合的药物，以期提高QNs残留提取效率，建立了一种简单、快速、高效和环保无污染的水产品样品前处理方法。

2实验部分

2.1仪器与试剂

Cary Eclipse荧光分光光度计（美国Varian公司）；1100液相色谱仪（美国安捷伦公司）； JJ2（200361）组织捣碎匀浆机（常州国华电器有限公司）。

ENX， NOR，CIP，LOM，ENR和GAT标准品（纯度 92.0%～97.0%，中国药品生物制品检定所）；鱼血清白蛋白（FSA，烟台大学生命科学学院提供），制备方法见文献[14]；PSA（N丙基乙二胺修饰的硅胶）粉末、Cleanert NH2 SPE（氨基修饰的硅胶）粉末（天津博纳艾杰尔公司）；草酸、柠檬酸、三氯乙酸（优级纯）和乙腈、甲酸（色谱纯）均为天津科密欧试剂公司产品。鲤鱼样品购于当地市场。

标准溶液的配制：ENX， NOR，CIP，LOM，ENR和GAT用1.0×10

Symbolm@@ 3 mol/L HCl溶液配制成1000 mg/L的单标和混合标准储备溶液。

2.2色谱条件

液相色谱条件：C18色谱柱（250 mm×4.6 mm）；柱温25℃；流动相为乙腈2%甲酸（15∶85， V/V）；流速为0.5 mL/min；检测波长280 nm；进样量20 μL。

2.3样品前处理

准确称取2.0 g匀浆后的样品（鲤鱼脊背肉）于20 mL聚四氟乙烯管中，加入10.0 mL 0.5 mol/L柠檬酸溶液，振荡，涡旋1 min，静置30 min。待沉淀完全后取上清液于20 mL聚四氟乙烯管中，残渣用5.0 mL 0.5 mol/L柠檬酸水溶液再次提取，两次提取液合并后取2 mL上清液， 加入20 mg PSA，涡旋，离心（6000 r/min）5 min，取上清液过0.45 μm滤膜后，供HPLC分析。

分 析 化 学第41卷

第10期李桂芝等： 柠檬酸水溶液生物亲和萃取高效液相色谱法检测鱼肉样品中喹诺酮类药物残留

3结果与讨论

3.1蛋白质对提取QNs回收率的影响

QNs与BSA（牛血清白蛋白）、FSA具有较强结合作用，结合常数大于104 mol/L[12～14]。为讨论提取QNs时，蛋白质、鱼油对回收率的影响，做如下实验： 取6个20 mL聚四氟乙烯离心管，编号1～6，分别向1和2管中加入0.5 mL水、向3和4管中加入0.5 mL 1.0×10

Symbolm@@ 3 mol/L FSA溶液， 向5和6管中加入10 mg鱼油；6个离心管中均加入10 μL 1000 mg/L QNs混合标准溶液，放置30 min。以GB/T 203662006[15]方法，用甲酸乙腈溶液作为提取液测定回收率。不同基质时，QNs提取回收率测定结果为：空白样品81.7%～87.9%； 蛋白质69.31%～73.3%；鱼油80.2%～87.2%。提取方法相同时，以FSA为基体的QNs提取回收率明显低于以水和鱼油为基体的回收率，说明QNs与FSA（模拟样品基体）的结合降低了QNs的提取效率，鱼油对QNs的提取率影响较小。因此在测定以蛋白质为主要基体的水产品中QNs残留时，应考虑蛋白质对萃取效率的影响。 [TS（][HT5”SS]图1不同弱酸浓度对鱼血清蛋白瑞利散射强度的影响

Fig.1Fish serum albumin （FSA） synchronous Rayleigh scattering intensity in different concentration of weak acid

a. 柠檬酸（Citric acid）； b. 草酸（Oxalic acid）； λex=λem=483 nm. CFSA=1.00×10

Symbolm@@ 6 mol/L。[HT5][TS）]

3.2蛋白质变性对QNs提取回收率的影响

3.2.1瑞利散射光谱研究不同浓度弱酸对蛋白质结构的影响当蛋白质浓度较低时，瑞利散射光谱可以反映出蛋白质的变性程度和分子结构变化，故采用共振瑞利散射研究不同浓度弱酸由图 1 可见，当柠檬酸和草酸这两种弱酸的浓度达到一定值时，蛋白质开始变性，蛋白质分子内部疏水基团外露，溶解性变小，形成小于散射波长尺度的小颗粒而产生瑞利散射[16]；当弱酸浓度合适时，形成散射的小颗粒浓度最大，瑞利散射强度也最大。当弱酸浓度进一步增加时，蛋白质变性速度加快，蛋白质之间疏水基团相互聚集形成尺度大于散射波长的大颗粒，引起瑞利散射强度迅速下降；当弱酸浓度过大时，蛋白质产生快速聚集，并最终形成沉淀，不再产生瑞利散射。当弱酸浓度适当时，蛋白质发生缓慢变性，与其结合的药物可以发生离解作用；如果弱酸的浓度太高则容易产生蛋白质聚集沉淀，对药物产生包裹作用。因此，在测定蛋白质为基体的样品中QNs残留时，可以选择合适的弱酸浓度实现药物的高效提取。

[TS（][HT5”SS]图2不同浓度柠檬酸水溶液对喹诺酮药物提取回收率的影响

Fig.2Effect of different concentration of citric acid on the recoveries of quinolones

1. 依诺沙星； 2. 诺氟沙星； 3. 环丙沙星； 4. 洛美沙星； 5. 恩诺沙星； 6. 加替沙星。

1. Enoxacin； 2. Norfloxacin； 3. Ciprofloxacin； 4. Lomefloxacin； 5. Enrofloxacin； 6. Gatifloxacin.[HT5][TS）]

3.2.2不同浓度弱酸对实际样品中喹诺酮药物提取回收率的影响为了进一步阐明不同浓度弱酸对实际样品中QNs提取回收率的影响，采用HPLC分析不同浓度草酸和柠檬酸提取液提取QNs时药物的回收率。分别准确称取2.0 g鱼肉样品于20 mL聚四氟乙烯管中，加入10 μL 1000 mg/L QNs混合标准溶液，放置30 min，用不同浓度弱酸提取液提取QNs，

计算回收率。结果表明，不同浓度的草酸提取液对鱼肉样品中QNs的提取回收率均低于50%；不同浓度柠檬酸水溶液对鱼肉样品中QNs的提取效率影响见图2。当柠檬酸浓度在0.1～2.0 mol/L时，提取液对QNs的提取回收率较高。这是因为此时柠檬酸水溶液使蛋白质发生缓慢变性， 释放了与其结合的药物。而当柠檬酸水溶液浓度大于2 mol/L时，蛋白质快速变性、凝聚而包裹了药物，因此回收率偏低。选择0.5 mol/L柠檬酸作为实际样品测定提取液。

3.3提取液净化步骤的改进

由3.1和3.2节可知，蛋白质对QNs残留的提取影响较大， 0.5 mol/L柠檬酸溶液可有效提取样品中的QNs。由于提取液为弱酸水溶液，极性较强，因此提取液中的脂溶性杂质较少，可以简化净化步骤。实验表明，PSA和Cleanert NH2的混合颗粒吸附剂可有效去除杂质，而对QNs吸附作用可以忽略。[TS（][HT5”SS]图3样品加标（0.5 mg/kg）的高效液相色谱图

Fig.3Chromatograms of six quinolones obtained by spiked fish sample. Sample spiked at 0.5 mg/kg

1. 依诺沙星； 2. 诺氟沙星； 3. 环丙沙星； 4. 洛美沙星； 5. 恩诺沙星； 6.加替沙星。

1. Enoxacin； 2. Norfloxacin； 3. Ciprofloxacin； 4. Lomefloxacin； 5. Enrofloxacin； 6. Gatifloxacin.[HT5][TS）]

3.4样品加标测定结果及方法的准确度、检出限与回收率

准确量取标准贮备液适量，用1.0 mmol/L HCl稀释成 0.025， 0.10， 0.40和1.6 mg/L的混合标准溶液，供HPLC分析，每个浓度进样3次，以平均峰面积（y）与相应的标准溶液浓度（x， mg/L）做线性回归分析，结果见表1。

对鱼肉空白样品进行3个水平（0.25， 0.5和1.0 mg/kg）的加标回收实验，样品前处理如2.3节所述，平行测定5次，样品加标色谱图见图3，计算结果见表1。结果表明，在本研究所选实验条件下，6种QNs 能被很好地萃取与分离， 回收率为82.0%～95.2%， RSD为1.9%～5.8%，根据DL=3S/N计算得出本方法的检出限为0.0055～0.016 mg/kg。本方法的回收率与精密度均好于国标方法，且样品前处理步骤少，便于操作。

2.1

3.5实际样品分析

用活鲤鱼进行了环丙沙星喂养实验，喂养量为每天20 mg/kg，连续喂养4 d，宰杀后取鱼肉进行环丙沙星残留检测，得到了阳性检验结果。

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