PMI基因作为选择标记的植物表达载体构建及转化白花丹参体系的建立

[摘要] 目的： 构建含有大肠杆菌6- 磷酸甘露糖异构酶（6-phosphomannose isomerase，PMI）基因并替换潮霉素抗性（hygromycin， hyg）基因的植物表达载体pCAMBIA1305-PMI，同时建立以PMI/甘露糖为筛选标记的白花丹参转基因体系。方法：首先从大肠杆菌Escherichia coli DH5α中克隆PMI基因，然后以PMI基因替换植物表达载体 pCAMBIA1305 中的hyg基因，构建了以PMI 基因为选择标记基因的植物表达载体pCAMBIA1305-PMI，并用电击转化方法导入根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciens LBA4404 中，用叶片浸染法转化白花丹参。结果：在白花丹参MS+6-BA 1.5 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1固体分化培养基中附加20 g·L-1甘露糖和10 g·L-1蔗糖为碳源的选择压力下，pCAMBIA1305-PMI 的转化率为23.7%，对再生植株用PCR检测证实了PMI基因的导入。结论：建立了以PMI-甘露糖为选择系统的白花丹参转基因体系，可应用于后续目的基因的转化奠定了基础。

[关键词] 6-磷酸甘露糖异构酶（PMI）基因；甘露糖；白花丹参；转基因筛选标记

传统方法获得的转基因植物中存留的抗生素筛选基因可能会危害人类肠道内的正常菌落或传播到周围环境中引起基因污染。虽然目前还没有关于标记基因迁移带来危害的报道[1]，但抗性标记基因潜在的生态环境和食用安全性一直颇具争议。因此，培育具有无抗生素的生物安全性标记基因的转基因植株势必成为未来植物转基因的重要发展方向。

6-磷酸甘露糖异构酶（phosphomannose isomerase，PMI）基因编码 6-磷酸甘露糖转移酶，其产物可催化 6-磷酸甘露糖转变为 6-磷酸果糖。自然界的植物大多没有PMI 基因（ manA），在含甘露糖的培养基上，内源果糖激酶催化甘露糖磷酸化为 6-磷酸甘露糖，从而使ATP 大量消耗。而催化产物 6-磷酸甘露糖不能被植物细胞利用，当其积累到一定程度时就会对细胞生长起到抑制作用。只有转入了外源PMI 基因的转化细胞才能继续代谢 6-磷酸甘露糖，并生产出 ATP，为细胞正常生长提供能量。所以，甘露糖在遗传转化中是一个有用的选择剂，使用PMI基因作为筛选方式的转基因系统要求在含有甘露糖的培养基上有生长优势。PMI作为新型安全的选择标记应用于植物的遗传转化，筛选程序简单、筛选剂价格低廉，而且不影响转化植株的代谢平衡和生长发育，不利变异少，筛选效果显著，对人体和环境无污染，在单子叶植物和双子

叶植物中均适用。利用此正选择系统转化甜菜，其转化频率是卡那选择系统的 10 倍[2]。另外在白菜、油菜籽、杨树和杏树等多种植物的基因工程研究中也有应用[3-7]。

白花丹参Salvia miltiorrhiza bge. f. alba C. Y. WU et H.W. Li是紫花丹参的变型，为山东特产药材之一。已做为一个新品种被收录进《山东省中药材标准》（2000 年版） [8-9]。白花丹参与丹参的化学成分基本相同，含有脂溶性成分丹参酮类，水溶性成分酚酸类，可以作为丹参的替代品。甘露糖为筛选剂的转化丹参的研究未见有报道。本研究首先构建了以PMI 基因作为筛选标记的植物表达载体并转化白花丹参，以期建立起具有生物安全性的白花丹参转基因体系， 为白花丹参的遗传改良提供技术资料。

1材料

大肠杆菌Escherichia coli DH5α、农杆菌LBA4404和植物表达载体pCAMBIA1301由本实验室保存。pMD18-T Vector载体、Taq DNA 聚合酶、DNA限制性内切酶、DNA Marker DL15000购自TaKaRa公司；T4 DNA连接酶、DNA凝胶回收试剂盒等购自宝生物公司。

2方法

2.1植物表达载体pCAMBIA1305-PMI的构建

用引物PMIF 5′ AAAACAGGGATTGATCAT 3′和PMIR 5′TTTCAGTAAGCTCTTACAGC 3′从大肠杆菌基因组中扩增PMI基因，然后连接到pMD18-TVector得到pMD18-T-PMI载体，测序验证。然后用带有XhoI接头的引物PMIxhou5′AGTCTCGAGATGCAAAAACTCATTAAC3′和PMIxhol5′CAGCTCGAG TTACAGCTTGTTGTAAACA 3′扩增pMD18-T-PMI 质粒，将PCR产物连入pMD19-T simple 质粒，得到pMD19-T simple-PMI质粒。用XhoI同时酶切pMD19-T simple-PMI和pCAMBIA1305质粒，分别回收pMD19-T simple-PMI的PMI基因片段和pCAMBIA1305的大片段，用T4 DNA连接酶连接，获得用PMI基因替换pCAMBIA1305里潮霉素抗性基因Hyg的植物表达载体pCAMBIA1305-PMI（图1）。

2.2重组载体的鉴定

重组质粒pCAMBIA1305-PMI首先XhoⅠ酶切鉴定PMI 是否插入；由于使用XhoⅠ单酶切连接，需要鉴定插入的方向，采用PCR 方法鉴定插入方向：在载体pCAMBIA1305上设计上游引物，在PMI 基因内部设计下游引物， 如果PMI基因片段正向插入，则可扩增出特定大小的产物， 若基因片段反向插入就无法扩增出产物，所设计的引物序列为：5′TCAACAGGCTGGCGAACAG 3′，5′CTTCAAAGCA AGTGGATTGAT 3′，产物为860 bp。

2.3重组载体pCAMBIA1305-PMI 转化白花丹参

选取10 d的丹参无菌苗叶片，接种于附加甘露糖和蔗糖不同浓度组合的不定芽诱导培养基中，设计7 个甘露糖-蔗糖（g·L-1），浓度组合为0∶30，5∶25，10∶20，15∶15，20∶10，25∶5，30∶0， 每处理接种外植体数为25 个，30 d 后观察统计，实验重复3次计算平均值

选取10 d的丹参无菌苗，将叶片剪成0.5 cm×0.5 cm的小块，置于MS+6-BA 1.5 mg·L-1+NAA0.1 mg·L-1固体培养基上，于25 ℃左右光照16 h/黑暗8 h的条件下预培养2 d。

重组载体pCAMBIA1305-PMI采用电击转化法导入根癌农杆菌LBA4404，4 ℃保存的平板上挑取含有pCAMBIA1305-PMI的LBA4404单菌落于新的含有50 mg·L-1 Rif（利福平）和50 mg·L-1 Kan的YEB培养基上，划线，30 ℃培养过夜（活化），挑取单菌落接种于15 mL含50 mg·L-1 Rif和50 mg·L-1 Kan（潮霉素）的YEB的液体培养基中，于28 ℃振荡培养至A600 0.5左右（250 r·min-1约23 h），将菌液倒入无菌离心管中，4 000 r·min-1离心10 min，弃上清液，用等体积的MS液体培养基重悬沉淀菌体，用于浸染。

将预培养材料放入MS重悬液中，在120 r·min-1的摇床上浸染20 min，取出外植体，用无菌滤纸吸去菌液，放入新的含400 mg·L-1cef（cefotaxime，母液为400 g·L-1） 的MS+6-BA 1.5 mg·L-1+NAA 0.1mg·L-1的共培养培养基中，黑暗中培养3 d，而后转入含400 mg·L-1 cef 的 MS+6-BA 1.5 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1+甘露糖20 mg·L-1筛选培养基上。 光照培养，30 d 后统计再生率（再生率=分化外植体/处理总外植体×100%），每个处理接种3 个外植体，重复3次，取平均值。 丛生芽在筛选培养基上生长1个月后，转入壮苗培养基MS+KT 1.5 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1+甘露糖20 mg·L-1壮苗培养，1个月后转入生根培养基中1/2 MS+NAA 1 mg·L-1中诱导生根。

2.4转化植株的PCR检测

提取分化植株的DNA， 根据PMI基因序列设计PCR 引物：上游 5′-GTATGGAAAATCCGTCCAGC-3′）和下游 （5′-TTTGCCATCACTTCCAGCGCCAG-3′），检测目的基因PMI（730 bp）是否插入植物基因组中。PCR 程序：94 ℃ 3 min； 94 ℃ 40 s， 55 ℃ 40 s， 72 ℃ 1 min，30 个循环；72 ℃ 7 min。

3结果和分析

3.1植物表达载体pCAMBIA1305-PMI 的构建

构建pCAMBIA1305-PMI的策略是用PMI替换pCAMBIA1305中的hyg，hyg的启动子和终止子保持不变。由于hyg两端的酶切位点只有XhoⅠ，而克隆有PMI的pMD18-T-PMI载体没有XhoⅠ酶切位点，因此设计引物PCR 扩增PMI全长序列，并在两端加上XhoⅠ位点，连接到pMD19-T simple-PMI质粒。首先用XhoⅠ酶切转化阳性克隆证实PMI 的插入（图2）。PMI的大小约是1.2 kb，非重组子（1）酶切后在1.2 kb 处没有切出条带，阳性重组子克隆（2）在1.2 kb 处切出预期的条带， 初步判断有PMI 的插入。PCR 结果进一步验证了PMI 的插入并鉴别了插入的方向（图3）。在5个XhoⅠ酶切鉴定有PMI 插入的克隆中，3个克隆扩增出860 bp 的条带（图3中的3， 4， 5），与设计的大小相符，说明这3个克隆中PMI是正向插入的。对照pCAMBIA1305 没有扩增出产物。

3.2重组载体转化白花丹参

3.2.1甘露糖筛选浓度的确定 采用7个浓度梯度的甘露糖和蔗糖浓度组合作为碳源分析甘露糖对白花丹参叶片不定芽分化的影响。外植体接种14 d 后，在不含甘露糖的诱导培养基上开始看到绿色芽点冒出；添加5，10 g·L-1甘露糖的处理也有绿色芽点，但绿色芽点数量减少，随着甘露糖浓度的增加，不定芽的数量逐渐减少，分化受到了抑制。20 d后，添加15 g·L-1甘露糖处理的外植体有少量芽点，而添加20 g·L-1甘露糖的处理在30 d后仍没有不定芽的分化，且外植体开始黄化死亡。这些实验结果说明甘露糖作为碳源对白花丹参叶片不定芽的生长有抑制作用（表1），因此选择20 g·L-1甘露糖和10 g·L-1蔗糖为碳源用于转化试验选择压。

3.2.2重组载体pCAMBIA1305-PMI转化白花丹参 pCAMBIA1305-PMI载体转化白花丹参叶片共培养后， 在20 g·L-1甘露糖和10 g·L-1蔗糖为碳源筛选培养基中，大多数外植体逐渐黄化，部分外植体12 d左右开始出现芽点。随后外植体长出丛生芽，丛生芽分开继代筛选，部分芽苗会长大（图4）。丛生芽在筛选培养基上生长1个月后，转入壮苗培养基MS+KT 1.5 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1+甘露糖 20 mg·L-1中壮苗培养。壮苗培养1个月后，转入生根培养基1/2 MS+NAA 1 mg·L-1中诱导生根。

3.2.3转化植株的PCR检测 以质粒pCAMBIA1305-PMI 为正对照、种子萌发的白花丹参植株叶片提取DNA 为负对照。PCR 检测的结果表明正对照和部分转化植株都扩增出了730 bp 的目的片段，负对照没有扩增出条带（图5），pCAMBIA1305-PMI 转化白花丹参转化率为23.7%，转化的结果也说明了构建载体的真实可靠，以甘露糖作为筛选标记的白花丹参转基因体系建立成功，可以进一步用于白花丹参的遗传转化。

〖XC陶如-6.TIF〗

图5 转基因苗的PCR检测

Fig.5 PCR analysis of transgenic plants

4结论

本研究通过同源克隆的方法成功分离得到大肠杆菌PMI基因，该基因的推导的氨基酸序列与报道的同源性为100%。在此基础之上成功构建了含有PMI基因的植物表达载体pCAMBIA1301-PMI，同时建立了以PMI-甘露糖为筛选体系的转基因体系，可应用于后续目的基因的转化，避免使用传统的NPTⅡ等选择标记，具有转化效率较高、对生态环境和食品安全性影响小等特点。为进一步利用该表达载体对作物进行遗传改良提供物质基础。

[参考文献]

[1] Puchta H.Marker-free transgenic plants[J].Plant Cell Tissue Organ Cult，2003，74：123.

[2] Joersbo M， Petersen S G， Okkels F T. Parameters interacting with mannose selection employed for the production of transgenic sugar beet [J].Physiol Plant， 2002，105：109.

[3] 续晨. 磷酸甘露糖异构酶基因选择标记遗传转化系统的研究[M]. 南京：南京林业大学，2005.

[4] Ku J J， Park Y H， Park Y D. A non-antibiotic selection system uses the phosphomannose-isomerase （PMI） gene for Agrobacterium-mediated transformation of chinese cabbage [J]. J Plant Biol， 2006， 49：115.

[5] Ramesh S A， Kaiser B N， Franks T， et al. Improved methods in Agrobacterium-mediated transformation of almond using positive （mannose/pmi） or negative （kanamycin resistance） selection-based protocols [J]. Plant Cell Rep， 2006， 25：821.

[6] Min B W， Cho Y N， Song M J， et al. Successful genetic transformation of Chinese cabbage using phosphomannose isomerase as a selection marker [J]. Plant Cell Rep，2007， 26：337.

[7] Wallbraun M， Sonntag K， Eisenhauer C， et al. Phosphomannose-isomerase （pmi） gene as a selectable marker for Agrobacterium-mediated transformation of rapeseed [J]. Plant Cell Tissue Organ Cult， 2009， 3：345.

[8] 马丽虹， 翟树林， 王传杰. 白花丹参的开发进展[J].中国林副特产，2005，20（1）：72.

[9] 郝岗平， 边高鹏， 张媛英. 泰山白花丹参干叶片高质量DNA的提取[J]. 中草药， 2006， 37（6）：855.

Construction of plant expression vectors with PMI gene as selection

marker and their utilization in transformation of Salvia miltiorrhiza f.alba

TAO Ru1， ZHANG You-can3， FANG Qian1， SHI Ren-jiu1， LI Yan-ling1， HUANG Lu-qi2*， HAO Gang-ping 1，2*

（1.Department of Basic Medcine， Taishan Medical University， Taian 271000， China；

2.National Resource Center for Chinese Materia Medica， China Academy of Chinese Medicinal Sciences，

Beijing 100700， China；

3.Department of Dermatology， Taian City Central Hospital， Taian 271000， China）

[Abstract] Objective： To construct plant expression pCAMBIA1301-PMI by substituting PMI for hygromycin resistance gene in pCAMBIA1301 and obtain transgenic Salvia miltiorrhiza f. alba using PMI-mannose selection system. Method： The 6-phosphomannose isomerase gene （PMI） of Escherichia coli was amplified by PCR. Sequence analysis showed that it shared 100% amino acids identities with the sequences of PMI genes isolates reported in the NCBI. Based on pCAMBIA1305， the plant expression pCAMBIA1305-PMI was constructed successfully by substituting PMI for hygromycin resistance gene in pCAMBIA1305. pCAMBIA1305-PMI was transformed into Agrobacterium tumefaciens LBA4404， and then the leaves of S. miltiorrhiza f. alba were inoculated in LBA4404 with pCAMBIA1305-PMI. Result： Plant expression pCAMBIA1301-PMI was successfully constructed and the leaves of S. miltiorrhiza f. alba inoculated in LBA4404 with pCAMBIA1305-PMI were selected on medium supplemented with a combination of 20 g·L-1 mannose and 10 g·L-1 sucrose as a carbon source. The transformation efficiency rate was 23.7%. Conclusion： Genetic transformation was confirmed by PCR， indicating that a new method for obtaining transgenic S. miltiorrhiza f. alba plants was developed using PMI-mannose selection system.

[Key words] 6-phosphomannose isomerase（PMI）； mannose； Salvia miltiorrhiza f. alba； selection marker of genetic transformation

doi：10.4268/cjcmm20140712