基于流式微球分析技术的超高灵敏度蛋白激酶活性分析

蛋白激酶引发的蛋白质磷酸化在细胞信号转导过程中发挥着极其重要的调控作用。研究表明，众多的人类疾病和蛋白激酶的活性异常密切相关，蛋白激酶也因而成为治疗癌症、炎症和其它免疫调控紊乱等复杂性疾病的重要药物靶点，开发、筛选小分子蛋白激酶活性抑制剂是当前新药研发的重要方向。因此，建立操作简单、成本低廉、灵敏度高的蛋白激酶活性检测方法是实现以蛋白激酶为靶点进行疾病诊断及新药开发的先决条件。传统激酶活性分析方法主要是依赖放射性32P标记或对特定磷酸化氨基酸位点具有特异性识别作用的亲和抗体来区分底物肽/蛋白是否被磷酸化。这两类方法都存在自身固有缺陷，如放射性标记会对人体以及环境产生危害，而磷酸化亲和抗体则受到制备复杂、成本高、操作繁琐等因素制约，因此开发非放射性、无需采用识别抗体的蛋白激酶活性分析方法仍是相关领域的研究热点。

最近，陕西师范大学化学化工学院刘成辉研究组提出了一种新颖的基于流式微球分析技术的蛋白激酶活性分析方法，以极为简单的操作实现了蛋白激酶A（PKA）的超高灵敏度检测，相关成果发表在Anal. Chem.， 2013， DOI： 10.1021/ac4024457。该研究组首先对多孔SiO2微球进行了化学修饰，使其表面包覆一层Zr4+离子层，而Zr4+能够特异性识别并捕获磷酸化多肽，从而克服了常规方法对放射性标记或亲和抗体的依赖。在磷酸化反应体系中，如果存在蛋白激酶（以PKA为例），则荧光素标记的底物肽将被磷酸化从而可被Zr4+修饰的SiO2微球识别并捕获到微球表面，而未磷酸化的荧光多肽不会与微球作用，因此，体系中激酶的活性越高，则微球表面富集的磷酸化多肽越多，微球的荧光信号越强，该研究创新性采用流式细胞仪实现了微球荧光信号的灵敏、快速分析。

由于Zr4+修饰的SiO2多孔微球比表面积大，可在微球表面快速、高选择性、高密度地富集磷酸化荧光底物肽，使荧光信号高度集中；同时，流式细胞仪兼具散射、荧光等多信号参数同时输出功能，可自动区分微球荧光信号与溶液中游离的荧光信号，因此该方法无需将微球与未磷酸化的游离荧光肽进行分离，将蛋白激酶磷酸化反应体系与Zr4+修饰的SiO2微球混合后即可直接进行流式分析，因此该方法在保证了高灵敏度的同时，极大地简化了检测步骤。随着小型便携式流式检测仪的逐步推广以及多孔板高通量进样模式在流式分析技术中的逐渐成熟，该方法在以蛋白激酶为靶点的疾病诊断及药物筛选领域展现出了良好的应用前景。