软骨细胞与骨髓基质细胞共培养裸鼠体内构建软骨组织的实验研究

[摘要]目的:探讨软骨细胞在裸鼠体内促进骨髓基质细胞(BMSCs)向软骨分化并形成软骨组织的可行性。方法:从SD大鼠中分别分离出BMSC和软骨细胞进行体外培养。收集软骨细胞培养上清液,作为BMSCs诱导液从第2代开始进行诱导分化,7天后取出标本,免疫组织化学检测软骨特异性Ⅱ型胶原表达,RT-PCR检测Ⅱ型胶原和aggrecan的mRNA表达。SD大鼠BMSCs与软骨细胞按一定比例(7:3)混匀,取5.0×107个混合细胞/ml的各组细胞悬液接种至壳聚糖生物材料,体外培养一周后植入裸鼠皮下,相同数量的单纯软骨细胞或BMSCs同样方法植入,分别作为阳性对照及阴性对照,1.5×107个软骨细胞同样植入作为低浓度软骨细胞对照。各组均8周后取材检测。结果:经诱导后的大鼠BMSCs的Ⅱ型胶原免疫组化检测阳性,RT-PCR检测Ⅱ型胶原和aggrecan mRNA呈阳性表达;混合细胞组及阳性对照组均形成了成熟的软骨,组织学可见成熟软骨陷窝、异染基质及Ⅱ型胶原表达;BMSCs组仅形成了纤维性组织;低浓度软骨细胞组在局部形成了少量软骨。结论:软骨细胞能在一定程度上提供软骨形成的微环境,诱导BMSCs在裸鼠体内向软骨组织分化并形成软骨组织。

[关键词]骨髓基质细胞;软骨细胞;软骨分化;软骨形成

[中图分类号]Q813.1 [文献标识码]A[文章编号]1008-6455(2010)02-0204-04

In nude mice vivo chondrogenesis of BMSCs induced by Co-transplantation of BMSCs and chondrocytes

MIAO Chun-lei,MU Shao-chun,LIANG Xiao-qin,ZHOU Guang-dong,TANG Sheng-jian

(Institute of Plastic Surgery,Weifang Medical College, Weifang 261041,Shandong,China)

Abstract:ObjectiveTo test the hypothesis that chondrocytes can promote in nude mice vivo chondrogenic differentiation and chondrogenesis of BMSCs at non-chondrogensis site.Methods We separated BMSC and cartilage cells from SD rats and cultured them. The supernatant of cartilage culture was separated as the BMSC inducing solution,and used to induce differentiation of the cells from the 2nd generation. Samples were taken 7 days later, and immunohistochemistry was applied to determine the expression of specific type Ⅱ cartilage collagen. RT-PCR was adopted to detect the expression of type Ⅱcollagen and aggrecan mRNA Porcine BMSCs and auricular chondrocytes were mixed at different ratios (7:3) and 5.0×107 mixed cells/mlwere suspended in chitosan,and then the mixture was imbed into nude mice subcutaneously as experimental groups. Chondrocytes or BMSCs at the same cell number were mixedimbeded respectively as controls. 1.5×107 chondrocytes were imbeded as low concentration chondrocyte control. All samples were collected at 8 weeks post-injection.ResultsAll specimens in experimental groups and chondrocyte group formed mature cartilage with collagen II expression. In contrast, specimens in BMSC group showed mainly fibrous tissue. Only a small amount of cartilage was formed in specimens of low concentration chondrocyte group.ConclusionThese results indicate that chondrocytes can promote in vivo chondrogenic differentiation and chondrogenesis of BMSCs .

Key words:bone marrow stromal cells; chondrocytes; chondrogenic differentiation; chondrogenesis

软骨缺损或损伤一直是外科临床治疗的难题。随着组织工程技术的发展,软骨组织工程为软骨缺损或损伤的理想修复提供了新的方法[1]。但种子细胞来源不足严重限制了软骨组织工程的临床推广应用。骨髓基质细胞 (BMSCs)由于其来源充足,取材损伤小,体外扩增能力强,且具有多向分化潜能,是软骨组织工程种子细胞的优良选择。许多研究证实:关节软骨微环境可以促进BMSCs向软骨细胞分化并形成成熟软骨组织[1-2]。本研究旨在探讨软骨细胞能否在裸鼠皮下这一非软骨形成部位提供软骨诱导微环境,促进BMSCs向软骨细胞分化并形成组织工程软骨。

1材料和方法

1.1 细胞培养

1.1.1 BMSC培养:在无菌条件下取SD大鼠股骨和胫骨,以无血清DMEM(美国Gibco BRL公司)离心洗涤2次,加入含有10%胎牛血清(美国HyClone公司)的DMEM,制成骨髓细胞悬液。计数有核细胞,以7.5×105个/cm2的密度接种于培养皿(美国Falcon公司),置于37℃、5% CO2、饱和湿度的条件下培养,贴壁法分离BMSCs,接种5天后首次换液。待细胞生长达到80%～90%融合后,用0.25%胰蛋白酶+0.02% EDTA消化,以1.5×104个/cm2的密度接种,常规传代扩增,第2代细胞用于实验。

1.1.2 软骨细胞培养:在无菌环境下取SD大鼠两侧肋软骨,剪碎成1 mm3组织块,磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗2次,0.25%胰蛋白酶+0.02% EDTA 37℃振荡消化30min,PBS冲洗2次,再以0.2%Ⅱ型胶原酶(美国Oncogene公司) 37℃振荡消化6～8h,过滤、离心、收集、计数,以2.5×104个/cm2的细胞密度接种于培养皿,体外常规培养与扩增,第2代细胞用于实验。

1.2 BMSC向软骨细胞的诱导培养:从软骨细胞P1开始,收集软骨细胞上清液,0.22μm滤网抽滤消毒,4℃保存备用。当P1 BMSC达到80%融合时,消化收集细胞,以1.5×104个/cm2细胞密度接种于培养皿中,其中预置载玻片,加入含10%胎牛血清的DMEM培养过夜。待细胞贴壁后,吸除培养液,加入软骨细胞上清液进行诱导培养,为诱导组。直接用全培养液培养的BMSC为未诱导组。每天半量换液,诱导7天后取出玻片,用95%冷丙酮固定玻片,进行免疫组化检测。收集培养皿内的剩余细胞进行RT-PCR鉴定。

1.3 细胞接种与体内移植:取第2代BMSCs与软骨细胞以7: 3(BMSCs: 软骨细胞)比例混合均匀后以5.0×107个/ml的终浓度接种于壳聚糖生物材料(直径9mm,高3mm)上。相同终浓度 (5.0×107个/ml) 的单纯软骨细胞和单纯BMSCs分别作为阳性对照组和阴性对照组。以1.5×107个/ml终浓度的少量软骨细胞(细胞浓度相当于上述3组的30%)作为低软骨细胞浓度对照组。各细胞-材料复合物于37℃、5%CO2、100%饱和湿度的条件下培养4～5h后加入加入含有10%胎牛血清(美国HyClone公司)的DMEM。体外培养一周后植入裸鼠皮下。

1.4 相关检测

1.4.1 Ⅱ型胶原表达检测:诱导7天后取出玻片,诱导组和未诱导组分别进行Ⅱ型胶原免疫组化染色,以软骨细胞做阳性对照,以1:100稀释的兔抗鼠Ⅱ型胶原单克隆抗体、PV两步法免疫组化试剂盒(北京中杉金桥生物有限公司)显示各组标本Ⅱ型胶原的表达情况。

1.4.2 RT-PCR鉴定:Trizol分别提取各组细胞的总mRNA,按逆转录试剂盒(上海生物工程有限公司)操作步骤逆转录得到cDNA。设计合成ColⅡ和aggrecan引物序列(ColⅡ上游引物5'-GTCCAGATGACTTTCCTCCGTC-3',下游引物5'-TGTCCACACCAAATT CCTGATC-3,325 bp;aggrecan上游引物 5'-GGAATCCCT AGCTGCTTAGCAG-3,下游引物5'-GAGTCATTGGAGCGAAGGTTC-3',458 bp )进行RT-PCR扩增,PCR条件为ColⅡ:95℃ 3 min; 95℃ 30s, 64℃ 30 sec, 72℃ 1.5 min/30 cycles; 72℃ 10 min;aggrecan:95℃ 3min; 95℃ 30s, 60℃ 30s, 72℃ 1.5 min/30 cycles; 72℃ 10 min。其产物用10g/L琼脂糖做凝胶电泳进行鉴定。

1.4.3 组织学检测:标本体内植入8周后取材,将形成的组织以10%甲醛固定24h,石蜡包埋,切片,行HE染色、Safranin O染色、Massion染色以及阿利辛兰染色。观察培养物的组织结构,生物材料降解情况以及软骨特异性细胞外基质和蛋白多糖分泌情况。

1.4.4 免疫组化检测:标本体内植入8周后取材以正常皮肤组织为阴性对照,以1:100稀释的抗Ⅱ型胶原单克隆抗体(鼠抗人,美国Chemicon公司)特异性结合标本中的Ⅱ型胶原,再经生物素化的二抗(羊抗鼠,美国Chemicon公司)结合,3,3'二氨基联苯胺(DAB)显色。显示各组标本Ⅱ型胶原的表达情况。

2结果

2.1 细胞培养:BMSCs呈纺缍形或梭形,原代集落样生长,12天后即可达到90%以上的融合状态;传代后可形成单层,类成纤维细胞样生长,排列具有一定的方向性(图1)。原代细胞一般12～24h贴壁,48h后细胞开始增殖。细胞刚刚贴壁时仍为圆形,伸展后呈多角形,以类似于同源细胞群的生长方式形成独立的小群体,中央密集处可形成软骨样结节。5天左右即可达到90%以上的融合状态(图2)。BMSC和软骨细胞在第2代以内均有很强的增殖能力,扩增后能够达到体内移植所需细胞数量。

2.2 Ⅱ型胶原表达检测:诱导组和软骨细胞Ⅱ型胶原免疫组化可见胞质被染成棕褐色的阳性细胞(图3A),而未诱导组中未见Ⅱ型胶原阳性细胞(图3B)。

2.3 RT-PCR:诱导细胞经RT-PCR扩增后,在300～500 bp之间接近300 bp和500 bp分别可见到两条明显的条带,说明经诱导的细胞中表达Ⅱ型胶原和aggrecan的mRNA,而对照组中未见表达(图4)。

2.4 大体观察和组织学检测:标本体内植入8周后,实验组和大量软骨细胞对照组部位均有成熟软骨组织形成,其外观和弹性与正常软骨极为相似,组织学可见标本内存在大量成熟的软骨陷窝。骨髓细胞组复合物只形成了少量软组织,组织学显示为纤维组织特征。低浓度软骨细胞组多数标本有一定量的软骨样组织形成,但新生软骨量明显少于实验组(图5)。

2.5 组织化学和免疫组化检测:阿里辛兰染色显示实验组和大量软骨细胞对照组标本细胞外基质具有异染特性,藏红花染色也显示标本的基质中含有大量的蛋白聚糖沉积(红染基质),与正常软骨着色基本一致。免疫组化结果还进一步显示实验组标本表达II型胶原(图6)。骨髓基质细胞组标本无软骨特异性基质着色,II型胶原表达阴性。少量软骨细胞组标本局部区域有软骨样基质沉积,但着色程度显著低实验组,II型胶原表达也较微弱。

3讨论

BMSCs来源充足,取材损伤小,体外增殖能力强,且具有软骨分化潜能,是优良的软骨组织构建种子细胞。目前促进BMSCs向软骨定向分化的主要方法是应用生长因子进行诱导,这些方法费用昂贵并可能因生长因子应用而产生副作用。已有研究证实[1-3],BMSCs在关节软骨缺损内能向软骨定向分化并形成软骨组织。本研究以此为根据,期望通过软骨细胞与BMSCs混合接种,使软骨细胞在皮下组织内形成一个软骨微环境,探讨BMSCs能否在这一微环境作用下向软骨分化并形成软骨组织。

在前期实验中我们将培养SD大鼠软骨细胞的上清液经0.22μm滤器过滤去除漂浮的软骨细胞而保留细胞分泌的蛋白质类生长因子,将上清液加入BMSC培养皿中7天后取出标本进行Ⅱ型胶原免疫组化检测,显示细胞分泌基质中含有大量软骨特异性的细胞外基质Ⅱ型胶原成分;而RT-PCR检测诱导前后细胞内Ⅱ型胶原和aggrecan mRNA表达。结果发现诱导组的Ⅱ型胶原和aggrecan mRNA表达阳性,而对照组则为阴性。进一步证实了诱导后的BMSC已向软骨细胞转化。

其后的实验结果表明少量的软骨细胞与大量的BMSCs在裸鼠体内共培养,能够形成较成熟的软骨组织,而新生软骨在大体外观、组织学特征、胞外基质染色、II 型胶原表达及GAG 含量等诸多方面均与相同细胞数量单纯软骨细胞移植形成的软骨非常相近。这提示在少量软骨细胞的诱导作用下,混合细胞组中大量的BMSCs可以基本取代软骨细胞的作用在非软骨环境中形成软骨。更重要的是,所有结果均表明混合细胞组形成软骨的质与量均明显优于低浓度软骨细胞组,表明BMSCs在混合组软骨形成过程中的确发挥了重要作用,直接参与了软骨再生。因为混合细胞组与低浓度软骨细胞组相比,软骨细胞数量是相近的,新生软骨量的成倍增加显然是由于混合组中大量BMSC的存在所致。而在单纯BMSCs注射组则未见软骨样组织形成,表明无软骨细胞诱导作用时,单纯BMSCs不能形成软骨组织。

已有研究表明:细胞是能够因为周围环境中其它细胞的影响而变化的[4-8],软骨细胞可以分泌多种生长因子如:转化生长因子(TGFβ)、胰岛素样生长因子(IGF)等[9-10],这些因子是公认的BMSCs向软骨细胞分化的诱导因子,软骨细胞分泌的这些可溶性因子可能在BMSCs软骨形成过程中发挥了重要作用。但我们的另一项实验表明,这些因子诱导的BMSCs注射到皮下很难形成均质成熟的软骨组织,说明软骨细胞产生的诱导机制中可能还需要其它因素参与。有文献报道关节软骨细胞的培养液能明显抑制血管内皮细胞增殖[11],而将关节软骨细胞与血管内皮细胞共培养则可加速软骨细胞的肥大与骨化进程[12],这说明血管化是软骨形成的不利因素,软骨细胞有可能会分泌某种抑制血管形成的因子阻止血管长入新生组织,从而促进了BMSCs在体内非软骨环境中形成软骨。此外,软骨的特异性细胞外基质成分(如II型胶原、硫酸软骨素等)及软骨细胞膜表面某些大分子(如整合素α2、β1)等也是软骨微环境的重要组成部分,对软骨细胞的增殖、粘附、分化状态维持及细胞间信号传导等生物活动具有重要作用,但其是否参与软骨细胞诱导BMSCs软骨分化过程尚需进一步深入研究。

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[收稿日期]2009-11-06 [修回日期]2010-01-13