利用米曲霉转化谷氨酸钠生成γ―氨基丁酸的研究

【关键词】米曲霉转化谷氨酸钠；γ-氨基丁酸；研究

639文章编号：1004-7484（2014）-06-3504-03

米曲霉是一种安全有益的菌种，利用米曲霉转化MSG（谷氨酸钠，以下简称MSG）生成GABA（γ-氨基丁酸，以下简称GABA）能提高制作GABA的安全性，达到食用级。

1米曲霉生成颗粒型的米曲霉菌球方法

1.1米曲霉菌球活化从保存培养基菌种中接种于平面培养基上进行活化，恒温箱中培养3天。之后，接种3环于200mL培养基（500mL三角瓶），于28℃、160r/min摇床中培养2天。

1.2米曲霉菌球酶活的测定取1g米曲霉菌球加入到50mL含1%MSG的醋酸-醋酸盐缓冲液（0.2mol/LpH4.6）中，37℃、140r/min摇床反应2h。0.22μm微滤膜过滤后，收集过滤液，测定GABA含量，计算酶活。

酶活U：在37℃，140rpm的摇床中反应1h，转化生成1μmol GABA的酶量。

1.3菌体生长与产酶关系的研究将活化后的米曲霉2%（v/v）转接到200mL发酵培养基中，共16瓶，每12h取出2瓶作为研究，滤纸过滤收集菌球，测定菌球湿重和酶活。以时间为横坐标，菌球的酶活和菌体湿重为纵坐标，绘制菌体生长与产酶关系图。

1.4米曲霉菌球的最适pH配制50mL不同pH浓度梯度的0.2mol/L醋酸钠缓冲液（pH3.5-5.6，1%MSG），往中加入1g米曲霉菌球，37℃、140rpm下反应2h取样测定GABA含量，计算酶活，以最高的酶活力为参比计算相对酶活。

1.5米曲霉菌球的pH稳定性称取1g菌球加入至7mL不同pH的醋酸缓冲液中，室温下保存2h后，于冷冻离心机中4℃、5000rpm离心10min，收集菌球。之后，加入到50mL含1%MSG的醋酸-醋酸盐缓冲液（pH4.6），测定酶活，以最高的酶活为参比计算相对酶活。

1.6米曲霉菌球的最适温度分别在30，40，50和60℃不同温度下，加入1g米曲霉菌球，37℃、140rpm下反应2h取样测定GABA含量，计算酶活，以最高的酶活力为参比计算相对酶活。

1.7米曲霉菌球的温度稳定性称取1g菌球加入至50mL醋酸盐缓冲液（0.2mol/LpH4.6）中，分别在30℃，40℃，50℃和60℃不同温度下保存2h。之后，往中加入1%MSG，37℃、140rpm的摇床中反应2h，测定酶活，以最高的酶活为参比计算相对酶活。

1.8化学物质对米曲霉菌球酶活的影响分别在50mL醋酸盐缓冲液（0.2mol/L，pH4.6，1%MSG）中加入CaCl2，FeCl3，KCl，KI，MgSO4，MnSO4，配置成含有1mM离子的缓冲液，测定这些离子对酶活的影响，以不添加以上化学物质的酶活为参比计算相对酶活。

1.9米曲霉菌球米氏常数及最大反应速率配制不同浓度谷氨酸钠的酶反应液体系（50-250mM），加入菌球1g，于37℃、140rpm摇床反应1h，测定各反应液中GABA含量，计算酶反应速度，并以1/v-v/[S]作图，其纵轴截距为1/Vmax，横轴上的截距为-1/Km。

1.10产物的生成与反应时间的关系在最适pH条件，同一反应体系下，以2g菌球/100mL反应体系的比例加入菌球，在不同的时间取样500μL测定反应产物GABA的生成量，以GABA含量为纵坐标，时间为横坐标绘制曲线。

1.11GABA定性检测在电热条件下，氨基酸与展层剂中的茚三酮反应可以生成特异性的有色物质，并根据GABA和MSG标准品在层析纸的位置，确定样品中是否含有GABA和MSG。该方法的主要特点是省时、便捷、经济、准确，适合定性研究氨基酸。其具体步骤如下：

展层剂的配制：组成为正丁醇：冰醋酸：去离子水=4：2：1，混合均匀，并加入0.4%的茚三酮充分溶解，避光密封放置于层析缸中备用。

准确量取2μL溶液点样于Whatman1号层析滤纸上，在层析缸中上行层析2h，吹干展开剂后于65℃烘箱中显色30min，即可得到纸谱图。

2米曲霉菌球酶学性质研究

2.1米曲霉菌球形态米曲霉菌球颗粒分明，形态以圆形为主。这些菌球的直径大约在2-5mm左右，与海藻酸钠固定化酶颗粒较为相似，具有易过滤的特性。

2.2GABA的定性测定。

条带1、2和3分别为米曲霉菌球反应液、标准对比液和米曲霉的发酵液。随着层析液的流动，氨基酸由于分子量不同，在层析纸上的流速不同，展现的位置也不一样，可以定性地确定不同种类的氨基酸。从图1中可知，条带3中没有GABA斑点，原因是发酵液的pH在6.5左右，不在菌球适宜pH范围内，抑制了菌球的酶活。然而，菌球催化反应体系中却有GABA，原因是反应液的pH4.8在米曲霉菌球的适宜pH范围内。以上结果表明，米曲霉菌球在适宜的pH条件下可以催化反应液，转化MSG成GABA。