大孔吸附树脂纯化黄芩总黄酮工艺研究

[摘要] 目的 研究大孔吸附树脂分离和纯化黄芩总黄酮的工艺条件。 方法 以总黄酮的吸附量和解吸率为考察指标，对8种不同类型的树脂进行评价。并对优选出的大孔树脂纯化黄芩总黄酮时的工艺条件及参数进行研究。 结果AB-8大孔吸附树脂的动态吸附分离效果最好，上样药液浓度为80 mg药材/mL，径高比为1∶8，吸附流速为1 BV/h，除杂溶剂为水，除杂体积为4 BV，除杂流速为1 BV/h，洗脱溶剂为50%乙醇，洗脱体积为8 BV，洗脱流速为1 BV/h。通过大孔吸附树脂分离纯化后，终产品中总黄酮的纯度为88.48%。 结论 该工艺合理、可行，适合工业生产。

[关键词] 黄芩；总黄酮；大孔吸附树脂；纯化

[中图分类号] R284.2 [文献标识码] B [文章编号] 1673-7210（2012）04（a）-0143-03

Studies on Purification Process of total flavones from Scutellaria bacalensis by macroporous adsorption resin

LU Ziming1,2 LI Zhihong2 LIANG Junqing2 LIU Xiaoyan2 WANG Yong2 TU Pengfei1

1.State Key Laboratory of Natural and Biomimetic Drugs, School of Pharmaceutical Sciences, Peking University, Beijing 100191, China; 2.Beijing Yiling Pharmaceutical Co., Ltd., Beijing 100027, China

[Abstract] Objective To investigate the process of isolation and purification of total flavones from Scutellaria bacalensis by macroporous adsorption resin. Methods The absorption amount and desorption ratio were taken as the investigation indexes to evaluated 8 kinds of resins. And the process and parameters of purification of total flavones from Scutellaria bacalensis by optimized macroporous adsorption resin were studied. Results The dynamic adsorption and isolation effect of AB-8 type macroporous adsorption resin was the best, with the drug solution concentration as 80 mg of medicinal material/mL, ratio of diameter and height as 1∶8, velocity of absorption as 1 BV/h, solvent of removing impurities as water, volume of removing impurities as 4 BV, velocity of removing impurities as 1 BV/h, solvent of elution as 50% of ethanol, volume of elution as 8 BV, velocity of elution as 1 BV/h. The purity of total flavones in the final product was 88.48% after isolation and purification by macroporous adsorption resin. Conclusion The process is rational, feasible and suitable for industrial production.

[Key words] Scutellaria bacalensis; Total flavones; Macroporous adsorption resin; Purification

黄芩为唇形科黄芩属黄芩（Scutellaria baicalensis Georgi）的干燥根，其性寒味苦，具有清热燥湿、泻火解毒、止血、安胎的功效[1]。现代药理研究表明，黄芩具有抗菌、镇静、抑制变态反应、抗氧化、利胆保肝等作用。黄酮类化合物为其有效成分[2]。本实验旨在优选出一种适合分离黄芩总黄酮的大孔树脂，并对优选出的大孔树脂分离黄芩总黄酮时的工艺条件及参数进行研究。

1 仪器与材料

UV-2550紫外分光光度计（日本岛津公司）；黄芩（购于河北省安国以岭饮片有限公司，经鉴定，符合《中国药典》2010年版一部标准，批号：570201）；黄芩苷对照品（中国药品生物制品鉴定所，批号：110715-200212）；XAD-8（北京康林科技有限责任公司）、LSA-10（西安蓝深特种树脂有限公司），AB-8、D101，HPD300，HPD400A（沧州宝恩吸附材料科技有限公司），S-8，DM130（三星树脂科技有限责任公司）。其他试剂均为分析纯，水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 上柱药液的制备

取200 g黄芩饮片，50%乙醇，溶剂用量8倍，提取3次，每次1.0 h，合并提取液，减压浓缩至无醇味，加水定容至2 500 mL，抽滤，备用，即每毫升药液相当于含80 mg生药材提取物。

2.2 黄芩总黄酮的含量测定

2.2.1 黄芩苷对照品溶液的配制 精密称取黄芩苷对照品11.34 mg，置于25 mL容量瓶中，加70%乙醇至刻度，摇均，即得，供紫外测定用。

2.2.2 黄芩总黄酮供试品溶液的配制 精密吸取提取液1 mL置25 mL容量瓶中，加70%乙醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

2.2.3 线性关系考察 精密吸取浓度为0.113 4 mg/mL的黄芩苷对照品溶液0.3、0.5、0.8、1.0、1.2 mL，分别置于10 mL容量瓶中，加70%乙醇稀释至刻度，摇均后置280 nm波长下测定，以黄芩苷对照品浓度为横坐标（C），吸光度（Y）为纵坐标绘制标准曲线，并进行线性回归，得回归方程Y = 0.005 9C+0.002（r = 0.998 8）。结果表明，黄芩苷在2.1～12.0 μg/mL浓度范围内与其吸光度线性关系良好。

2.2.4 精密度试验 选取某一浓度的对照品溶液，连续测6次，按上述条件测定吸光度，结果得RSD = 0.28%。

2.2.5 稳定性考察 选取某一浓度的供试品溶液，按上述条件测定吸光度，间隔2 h测定1次，结果24 h内稳定，结果得RSD = 0.35 %。

2.2.6 重复性试验 取同一供试品溶液连续测定6次，结果得RSD = 0.37%，表明方法重复性良好。

2.3 大孔吸附树脂的预处理

于95%乙醇浸泡24 h后，湿法装柱，并用95%乙醇动态洗脱5倍树脂体积，水洗至无醇味，依次用5%盐酸（浸泡6 h后，水洗至中性）和5%氢氧化钠（浸泡6 h后，水洗至中性）处理，最后用95%乙醇动态洗脱至流出液加水（体积比1∶5）不变混浊为止，用水置换出乙醇后备用。

2.4 静态吸附

取预处理好的树脂各15 mL，置200 mL容量瓶中，然后分别加入药液50 mL，加水定容，时时振摇24 h，使树脂充分吸附。滤过，滤液适当稀释后，测定溶液中总黄酮的含量，计算静态吸附量。加95%乙醇200 mL于容量瓶中，时时振摇24 h，使树脂充分解吸附。滤过，滤液适当稀释后，测定溶液中总黄酮的含量。计算吸附量、吸附率、解析量和解析率，结果见表1。

吸附量=（上样液中总黄酮的质量浓度×上样液体积-水洗液中总黄酮的质量浓度×水洗液的体积）/树脂的体积

吸附率=（上样液中总黄酮的质量浓度×上样液体积-水洗液中总黄酮的质量浓度×水洗液的体积）/（上样液中总黄酮的质量浓度×上样液体积）×100%

解吸量=95%醇洗液中总黄酮的质量浓度×醇洗液的体积/树脂体积

解吸率=解吸量/吸附量×100%

表1 8种型号树脂对黄芩总黄酮的静态吸附行为

2.5 动态吸附考察

取20 mL不同型号已处理好的树脂分别装入色谱柱，测定死体积后，将一定浓度样品溶液通过树脂柱，以相同的1 BV/h流速进行动态吸附，流出液每10毫升接收一份，每一份取适量，用盐酸-镁粉反应，并辅以TLC薄层检测流出液的黄酮类化合物，待盐酸-镁粉反应呈阳性时，停止上样，记录上样量，用4 BV水洗，收集水洗液定容于1 000 mL量瓶中，测定溶液中总黄酮的含量。再用80%乙醇洗脱，洗至洗液近无色，收集洗脱液于1 000 mL量瓶中，定容，测定溶液中总黄酮的含量。计算吸附量、吸附率、解析量和解析率，结果见表2。

从表1、2可以看出，AB-8、HPD300和XAD-8三种树脂的静态吸附和动态吸附结果好于其他五种树脂，从适用性、生产性及经济性等方面综合考虑，选择AB-8。

2.6 吸附过程参数考察

2.6.1 上样浓度考察 将不同浓度的样品溶液（100、80、60、40 mg/mL）分别通过湿体积为20 mL的AB-8树脂柱，以1 BV/h的流速进行动态吸附。按“2.5”项下“用盐酸-镁粉反应……定容，测定溶液中总黄酮的含量”操作。结果，上样体积分别为80、100、135、200 mL；总黄酮解吸率分别为77.78%、87.40%、87.54%、87.69%。由结果可知，60～80 mg/mL均较合适，考虑到上样体积，选择80 mg/mL。

2.6.2 径高比考察 选择直径不同的色谱柱4根，湿法装入20 mL AB-8树脂使树脂径高比分别达到1∶10、1∶8、1∶6、1∶4，取浓度为80 mg/mL的样品溶液通过树脂柱，以1BV/h的流速进行动态吸附。按“2.5”项下用“盐酸-镁粉反应……定容，测定溶液中总黄酮的含量”操作。结果，上样体积分别为100、95、91、85 mL；总黄酮解吸率分别为91.01%、91.58%、86.67%、77.98%。由结果可知，径高比1∶10～1∶6没有显著性差异，选择1∶8。

2.6.3 吸附流速考察 取浓度为80 mg/mL的样品，通过大孔树脂色谱柱（树脂体积20 mL，径高比1∶8），分别以1 BV/h、2 BV/h，3 BV/h的流速进行动态吸附。按“2.5”项下“用盐酸-镁粉反应……定容，测定溶液中总黄酮的含量”操作。结果，上样体积分别为100、80、60 mL；总黄酮解吸率分别为91.77%、75.14%、52.70%。由结果可知，流速影响较明显，流速为1 BV/h较好。

2.7 除杂过程各参数考察

2.7.1 除杂体积考察 取浓度为80 mg/mL的样品，通过大孔树脂色谱柱（树脂体积20 mL，径高比1∶8），分别以1 BV/h的流速进行动态吸附。用盐酸-镁粉反应，并辅以TLC薄层检测黄酮类化合物。待反应呈阳性时，停止上样，水洗除杂，每20毫升接受一份，每一份取适量进行盐酸-镁粉反应（检识黄酮类化合物）和Molish反应（检识糖或糖苷类化合物），确定最佳洗脱体积。结果为水洗4倍体积最合适。

2.7.2 除杂流速考察 取浓度为80 mg/mL的样品，通过大孔树脂色谱柱（树脂体积20 mL，径高比1∶8），分别以1 BV/h的流速进行动态吸附。用盐酸-镁粉反应，并辅以TLC薄层检测黄酮类化合物。待反应呈阳性时，停止上样，然后分别用1 BV/h、2 BV/h、3 BV/h水洗除杂，水洗体积为4 BV，收集水洗液，定容于1 000 mL量瓶中，测定溶液中总黄酮的含量。再用80%乙醇洗脱，洗至洗液近无色，收集洗脱液于1 000 mL量瓶中，定容，测定溶液中总黄酮的含量。结果为总黄酮解吸率分别为91.77%、75.14%、52.70%，确定1 BV/h的除杂流速较好。

2.8 洗脱过程各参数考察

2.8.1 洗脱溶剂考察 取浓度为80 mg/mL的样品，通过8根AB-8大孔树脂色谱柱（树脂体积20 mL，径高比1∶8），分别以1 BV/h的流速进行动态吸附。用盐酸-镁粉反应，并辅以TLC薄层检测流出液的黄酮类化合物。待反应呈阳性时，停止上样，记录上样量，用4 BV水洗，收集水洗液定容于1 000 mL量瓶中，测定溶液中总黄酮的含量。再分别用10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%，醇洗脱至盐酸-镁粉反应呈阴性，收集洗脱液于1 000 mL量瓶中，定容，测定溶液中总黄酮的含量。洗脱液用量分别为950、800、675、500、400、250、200、150 mL；总黄酮解吸率分别为17.30%、23.91%、29.15%、61.25%、72.78%、80.10%、83.60%、87.08%。

2.8.2 洗脱流速考察 取浓度为80 mg/mL的样品，通过3根大孔树脂色谱柱（树脂体积20 mL，径高比1∶8），分别以1 BV/h的流速进行动态吸附。按“2.8.1”项下“用盐酸-镁粉反应……定容，测定溶液中总黄酮的含量”操作。再分别用70%醇洗脱至盐酸-镁粉反应呈阴性，收集洗脱液于1 000 mL量瓶中，定容，测定溶液中总黄酮的含量。

2.8.3 洗脱体积考察 取浓度为80 mg/mL的样品，通过3根大孔树脂色谱柱（树脂体积20 mL，径高比1∶8），分别以1 BV/h的流速进行动态吸附。按“2.8.1”项下“用盐酸-镁粉反应……定容，测定溶液中总黄酮的含量”操作。再分别用70%醇洗脱，每50毫升洗脱液收集一份，共收集洗脱液7份（即18倍柱体积），测定每份洗脱液中总黄酮的含量，结果分别为60.60%、25.66%、7.11%、2.35%、1.84%、1.52%、0.93%。前三份洗脱液中总黄酮的量之和已经大于95%，可见洗脱体积为7.5倍时已达95%，洗脱体积8倍即可。

2.9 树脂使用次数考察

取浓度为80 mg/mL的样品，通过大孔树脂色谱柱（树脂体积50 mL，径高比1∶8），以1 BV/h的流速进行动态吸附。用盐酸-镁粉反应，并辅以TLC薄层检测流出液的黄酮类化合物，待反应呈阳性时，停止上样，记录上样量，用4倍柱体积水洗，水洗流速为1 BV/h，收集水洗液定容于1 000 mL量瓶中，测定溶液中总黄酮的含量。再用80%乙醇洗脱，醇洗体积为8 BV，收集洗脱液于1 000 mL量瓶中，定容，测定溶液中总黄酮的含量。

树脂使用一次后，用95%乙醇处理，重复使用，并依次进行试验，共使用11次，测定每次总黄酮的吸附量，当总黄酮吸附量降低到最大吸附量的70%时，停止使用。第10次总黄酮的吸附量为最大吸附量的61%，第9次总黄酮的吸附量为最大吸附量的75%，可见树脂最多使用次数为9次，耐用性比较好。如果再用酸碱处理后，可能还能重复使用多次。

2.10 验证工艺考察

按上述所确定的吸附和洗脱条件，即：上样液浓度为80 mg药材/mL，径高比为1∶8，吸附流速为1 BV/h，除杂溶剂为水，除杂体积为4 BV，除杂流速为1 BV/h，洗脱溶剂为50%乙醇，洗脱体积为8 BV，洗脱流速为1 BV/h。平行制备三批样品，依照上法测定出膏率分别为17.41%、18.97%、18.31%，平均值为18.23%；黄酮的含量分别为89.26%、87.74%、88.45%，平均值为88.48%。因此，此工艺可用于生产黄芩总黄酮，而且树脂可以再生，成本较低，无污染，生产周期短，适合大规模生产。

3 讨论

文献[3-4]报道采用70%乙醇为溶剂进行渗漉提取，浓缩后，用乙酸乙酯萃取分离出苷元，将水层部分用大孔吸附树脂进行纯化。该工艺采用渗漉提取法，时间较长，溶剂耗费量大，采用乙酸乙酯萃取，增加了工艺流程，对环境和人体不够友好。文献[5]报道采用D241树脂分离纯化黄芩总黄酮，但是D241树脂属于离子交换树脂，实际操作涉及离子交换树脂的再生和提取溶液酸碱性的调整，纯化工艺步骤较多，比较繁琐。这些工艺均不适宜于工业化生产。大孔吸附树脂柱径高比的考察是与实际生产场地、设备安装有关的因素，而文献[6]中没有考察这些。文献[7]中采用正交试验设计法考察样品溶液的浓度、上样液pH值、上样流速这3个条件对大孔树脂吸附黄芩苷的影响，实际上这3个因素互相影响并不大，正交试验设计法并不太适用于大孔吸附树脂纯化化合物的工艺研究。

作者在综合多篇文献的基础上，进行了本文的实验。确定大孔吸附树脂纯化黄芩总黄酮的工艺即：选择AB-8大孔吸附树脂，上样药液浓度为80 mg药材/mL，径高比为1∶8，吸附流速为1 BV/h，除杂溶剂为水，除杂体积为4 BV，除杂流速为1 BV/h，洗脱溶剂为50%乙醇，洗脱体积为8 BV，洗脱流速为1 BV/h。该工艺合理、可行，适合工业生产。

[参考文献]

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[2] 杨娟，傅军鹏.黄芩活性成分及药效研究近况[J].实用医药杂志，2004， 21（3）：271-273.

[3] 刘昌，魏元锋，刘新国，等.利用大孔吸附树脂对黄芩总黄酮的纯化研究[J].云南中医学院学报，2007，30（3）：40-47.

[4] 魏元锋，刘新国，韩建伟，等.HP20树脂纯化黄芩总黄酮的研究[J].湖北中医杂志，2007，29（2）：50-51.

[5] 周小华，陈器，吴方国.D241树脂分离纯化黄芩总黄酮的研究[J].离子交换与吸附，2002，18（1）：36-44.

[6] 徐晶，陈再兴，袁昌鲁.大孔吸附树脂富集纯化黄芩总黄酮的工艺研究[J].中医药学刊，2006，24（9）：1648-1649.

[7] 宣寒，陈钧，杜丰玉，等.大孔吸附树脂分离纯化黄芩中黄芩苷的工艺研究[J].时珍国医国药，2006，17（10）：1992-1994.

（收稿日期：2011-12-02 本文编辑：卫 轲）