大孔吸附树脂分离纯化白屈菜总生物碱的研究

摘要：采用紫外可见分光光度法测定白屈菜（Chelidonium majus）总生物碱的含量，比较了10种大孔树脂对白屈菜总生物碱的吸附和解吸性能，从中筛选出适合分离纯化白屈菜总生物碱的大孔吸附树脂，并对其吸附和解吸条件进行了探讨。结果表明，HPD600树脂为纯化白屈菜总生物碱的良好树脂，确定最佳吸附流速2.0 BV/h，吸附液pH对吸附影响较小，解吸剂为70%～80%乙醇。经HPD600树脂精制得到的白屈菜总生物碱相对含量为39.8%，该结果可为白屈菜总生物碱的开发利用提供理论依据。

关键词：白屈菜（Chelidonium majus）；总生物碱；大孔吸附树脂；纯化

中图分类号：S567.23+9；R284.2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）08-2082-04

DOI：10.14088/ki.issn0439-8114.2016.08.041

Abstract：The absorption and desorption properties of ten kinds of macroporous resin were studied.Of the ten resins screened.The results showed that HPD600 was the best type to isolate alkaloids from the Chelidonium majus. The total content of alkaloids was measured by UV・spectrophotometric method.It is indicated that the optimum condition to purify total alkaloids by HPD600 was to control the flow velocity at 2 BV/h， pH value at 6.0～7.0 and with 70%～80% ethanol as washing solution. The total alkaloids produced by this process was brown powder，and the content was up to 39.8%，which laid a foundation for the development and utilization of total alkaloids from Chelidonium majus.

Key words：Chelidonium majus；total alkaloids；macroporous resin；purification

白屈菜（Chelidonium majus）为婴粟科白屈菜属植物，喜生于山谷的湿润地带，林缘水沟边，主要分布于中国的东北、华北、西北地区，是北方山区常见的药用植物。白屈菜全草均可入药，具有清热解毒、镇痛、止咳、平喘、疗疮消肿等功能。白屈菜中含有多种活性成分，已从白屈菜中分离鉴定出29种生物碱，主要包括白屈菜碱、白屈菜红碱、血根碱等。草身含生物碱0.97%～1.87%，而根含生物碱最高，为1.90%～4.14%[1]。现代研究发现白屈菜生物碱具有显著的镇痛、祛痰止咳、抗炎抑菌、抗肿瘤和抗病毒等多种生物活性，因此越来越受到人们的重视[2]。

目前常用的酸水提取或乙醇提取并结合有机溶剂萃取法虽然可以去除大量杂质，但白屈菜生物碱的分离、富集、纯化仍然有一定的难度。大孔吸附树脂则是一种比较理想的纯化生物碱的手段，杂质和目标物因功能基团和分子大小的差异，在大孔树脂上表现出吸附性的强弱，从而达到分离效果[3，4]。选用合适的大孔吸附树脂是纯化的关键，本研究对国产主要大孔吸附树脂纯化白屈菜总生物碱进行了筛选，从中筛选出较为理想的树脂，并对树脂分离纯化工艺进行了优化，旨在为白屈菜总生物碱的开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料：白屈菜于2014年7月采集自河北邯郸市武安长寿村，由邯郸学院生命科学与工程学院焦云红副教授鉴定，采集后迅速杀青、阴干并粉碎过40目筛，低温冷藏备用。

试剂：白屈菜红碱标准品（上海彩佑实业有限公司）；无水乙醇、盐酸均为分析纯；大孔吸附树脂：HPD-600、HPD-722（沧州宝恩吸附材料科技有限公司），D-101、AB-8（安徽三星树脂科技有限公司生产），LX-1、LX-11、LX-17、LX-60、LSA-21（西安蓝晓科技新材料股份有限公司），DM-21（山东鲁抗立科药物化学有限公司）。

仪器：分析天平、超声波清洗仪、UV6500型紫外可见分光光度计、精密酸度计、真空干燥箱、全温振荡培养箱、电热恒温水浴锅、旋转蒸发仪。

1.2 方法

1.2.1 大孔吸附树脂的预处理 先用1～2 BV 95%乙醇浸泡各类型大孔吸附树脂24 h，用蒸馏水冲洗至无醇味，然后分别用2 BV 4%～6% NaOH溶液和4%～6%盐酸溶液浸泡2 h以上，蒸馏水洗至pH中性，即可使用。

1.2.2 白屈菜提取物的制备 称取白屈菜粉末500 g，按质量体积比1∶6加入60%乙醇溶剂，在55 ℃条件下提取3 h，提取3次，提取液离心后抽滤得过滤液，减压浓缩得到白屈菜总生物碱浸膏，4 ℃冰箱保藏备用。使用前用蒸馏水溶解并过滤。

1.2.3 白屈菜总生物碱含量测定 最大吸收波长的确定：称取干燥的白屈菜红碱标准品0.01 mg置于容量瓶中，用95%乙醇溶解配制成浓度为0.01 mg/mL的标准溶液。取适量标准溶液，在200～600 nm范围内全程扫描，结果发现白屈菜红碱在282 nm处有最高吸收峰，确定282 nm为测定波长。

标准曲线的制备：分别移取浓度为0.01 mg/mL的标准溶液0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mL的标准液于25 mL容量瓶中，95%乙醇定容之后，用紫外分光光度计在282 nm下测定吸光度（A），以所得A值对标准品浓度进行线性回归，求回归方程为A=986.5X-0.009 3；R2=0.999 5。

总生物碱含量的测定：取适量样品溶液，按照标准曲线制作方法操作。定容后在282 nm 波长下测定吸光度A，根据回归方程计算出总生物碱浓度，结合提取液体积测定出总生物碱的含量。

1.2.4 静态吸附量和解吸率测定

1）静态吸附量的测定。将预处理后的大孔树脂各称取5 g置于相对应的已标记好的250 mL锥形瓶中，每种树脂平行3组，分别加入已知含量的白屈菜提取液50 mL，置摇床振荡，摇床温度设为25 ℃，时间设为3 h，吸附完成后，过滤，用紫外分光光度计测定滤液的吸光度，求得白屈菜总生物碱的含量，并根据标准曲线计算各类型树脂的吸附量。取3次结果的平均值。

Q1=（C0-C1）×V1/m α=（C0-C1）/C0×100%

式中，Q1为大孔树脂吸附量（mg/g），α为大孔树脂吸附率（%），C0为白屈菜提取液起始浓度（mg/mL），C1为残余浓度（mg/mL），V1为溶液体积（mL），m为树脂质量（g）。此计算方法吸附前后体积假定不变。

2）静态解吸率的测定。将静态吸附饱和的树脂用蒸馏水冲洗干净，分别加入80%乙醇75 mL于已标记好的250 mL锥形瓶中，各种树脂平行设置3组，放入摇床振荡，振荡温度设为25 ℃，时间设为3 h，解吸完全后，抽滤，收集滤液，测定滤液的吸光度，求得总生物碱的含量，计算各树脂的解吸率，取3次重复的平均值。

β=[C2V2/（C0-C1）V1]×100%。

式中，C2为解吸液浓度（mg/mL）；V2为解吸液体积（mL）；β为大孔树脂解吸率（%）。

1.2.5 HPD600大孔吸附树脂纯化白屈菜总生物碱的工艺 称取100 mL HPD600树脂，经预处理后，湿法装入层析柱子中，使用前用纯净水冲洗至中性状态。按照上述制备提取液方法制备一定量的白屈菜提取液，并测定提取液中生物碱的含量；以一定的吸附速率上大孔树脂柱，待上柱完成后，检测下柱子水中生物碱的损失量，然后用2 BV的纯净水洗涤。用3 BV的洗脱剂进行洗脱，洗脱流速调节在1.5 BV/h，收集洗脱液，减压浓缩，将浓缩液进行冷冻干燥，测定洗脱液中总生物碱的含量。考察样品溶液pH、样品溶液浓度、吸附速率及乙醇体积分数、流速、解吸液用量对解吸的影响。

1）pH对白屈菜总生物碱吸附效果的影响。将一定浓度的白屈菜提取液50 mL分别用0.5 mol/L NaOH溶液、0.5 mol/L HCl溶液配成不同pH，按“1.2.3”的方法测定总生物碱的含量，计算吸附率，重复3次，取平均值。

2）流速对总生物碱吸附效果的影响。将一定浓度的白屈菜提取液分别以1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 BV/h的流速上柱，收集不同倍数树脂体积（BV）溶液，按“1.2.3”的方法测定总生物碱含量，考察不同流速下树脂的吸附效果，重复3次，取平均值。

3）样品浓度对总生物碱吸附效果的影响。将一定浓度的白屈菜提取液分别配制成浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mg/mL，以2.0 BV/h的流速通过树脂，收集不同倍数树脂体积（BV），按“1.2.3”的方法计算总生物碱含量，考察不同浓度下的吸附效果，计算吸附率，重复处理3次，取平均值。

4）乙醇体积分数对解吸效果的影响。树脂吸附总生物碱达到饱和后，用去离子水洗涤至流出液呈澄清状态。然后用不同体积分数的乙醇以2 BV/h的流速冲洗树脂柱进行解吸，重复3次，测定总生物碱的含量，计算解吸率。

1.2.6 HPD600动态解吸曲线 白屈菜提取液通过HPD600树脂柱吸附饱和后，用4倍量的去离子水洗涤树脂，至流出液无颜色，再用70%乙醇溶液通过树脂柱解吸，解吸液每0.5 BV为一流份，直至解吸完全。洗脱时流速越高，拖尾现象越明显，所需要的洗脱剂越多，根据查阅资料，一般解吸流速为吸附流速的1/2，因此以1 BV/h为洗脱流速，绘制动态解吸曲线。

2 结果与分析

2.1 树脂的选择

从表1可以看出，所选10种大孔吸附树脂对白屈菜提取液中的生物碱均有一定的吸附量，但差异明显，其中非极性树脂LX-60、HPD600的吸附量达到38 mg/g以上，高于另外8种树脂的吸附效果，而极性树脂LX-17的吸附量仅为19.71 mg/g。LX-60的吸附量最高，为42.65 mg/g，但该树脂的解吸率为59.66%，而HPD600的解吸率为91.32%，综合树脂吸附量与解吸率分析，采用大孔吸附树脂HPD600分离纯化白屈菜总生物碱更为合适。

2.2 HPD600大孔吸附树脂纯化白屈菜总生物碱的工艺

2.2.1 pH对总生物碱吸附效果的影响 由图1可以看出，在pH为3.0～9.0，白屈菜总生物碱在HPD600树脂的吸附率差异不明显，均在88%左右，相对而言，在pH为6.0时，吸附率最高，达到89.36%。因此，在生产中可以选择pH在6～7的中性状态，同时可以节约调节酸碱度带来的成本。

2.2.2 流速对总生物碱吸附效果的影响 由图2可以看出，样品溶液的流速越慢，吸附效果越好，几种流速中，从1.0～2.0 BV/h的吸附率变化不显著，吸附率均在85%以上，而当吸附流速为2.5 BV/h时，白屈菜总生物碱的吸附率为83.2%，但当流速为3.0 BV/h时，总生物碱尚未及时被吸附就随着吸附液流出，吸附率降为75.8%。综合考虑生产效率和成本核算，选择2.0 BV/h流速比较合适。

2.2.3 浓度对总生物碱吸附效果的影响 由图3可以看出，样品浓度在0.2～0.8 mg/mL时，白屈菜总生物碱的吸附率变化不明显，但随样品质量浓度的增加，浓度达到1.0 mg/mL以上时，上样过程中部分生物碱形成絮状沉淀析出，导致吸附减少，容易堵塞树脂，随着样品体积的增加，总生物碱的析出增加，回收率降低。但如果样品液浓度太低，上样需要较长时间，导致生产效率降低，综合考虑，选择样品的上柱浓度为0.8 mg/mL左右最佳。

2.2.4 乙醇体积分数对解吸能力的影响 试验中选择的解吸液为30%～90%乙醇溶液，由图4可以看出，随着乙醇体积分数增加，解吸率逐渐升高，乙醇体积分数为70%时，总生物碱的解吸率最高为88.28%，继续增加乙醇体积分数为80%时，解吸率几乎没有变化，为88.17%，但当乙醇体积分数为90%时的解吸率略降低，不同体积分数的乙醇其极性不同，70%～80%的乙醇与总生物碱的极性较为接近，同时考虑到节约成本，试验确定70%乙醇为最佳解吸剂。

2.2.5 HPD600动态解吸曲线 图5显示，70%乙醇洗脱液通过树脂柱1/2时总生物碱开始被洗脱下来，1.5 BV后迅速升高，乙醇通过3.0 BV后，解吸达到最高峰，当通过4.0 BV解吸液时，树脂上吸附的总生物碱基本上洗脱下来。从整个图谱可以看出，该方法出峰快，且无明显拖尾现象。合并解吸液减压浓缩，真空干燥得到白屈菜总生物碱，总生物碱得率为3.12%，相对含量为39.8%。刘楠楠[5]曾用AB-8提取纯化白屈菜总生物碱，结果得到提取的总生物碱得率为2.74%，总生物碱相对含量为35.54%。

3 结论

对10种大孔树脂的筛选试验结果表明，HPD600大孔吸附树脂对白屈菜生物碱具有良好的吸附和解吸能力，适用于白屈菜生物碱的纯化。上柱流速越快，总生物碱的泄露点出现得越早，综合考虑生产效率和成本核算，采用2 BV/h的上柱流速，pH为6.0～7.0时上柱，此pH条件下的吸附效果最好，70%～80%乙醇的解吸率最高。动态解吸试验证明，上述洗脱方法可行，出峰快，且无明显拖尾现象。经HPD600纯化后的白屈菜生物碱，通过UV检测总生物碱的含量，得率为3.12%，相对含量为39.8%，可见HPD600大孔吸附树脂可以作为一种良好的白屈菜总生物碱纯化树脂使用。

参考文献：

[1] 于 敏，陈红卫，焦连庆，等.白屈菜的研究进展[J].特产研究，2008（2）：76-78.

[2] 刘翠哲，咚继铭，张丽敏，等.白屈菜总生物碱对豚鼠的平喘作用[J].中国医院药学杂志，2006，26（1）：26-27.

[3] 刘俊红，魏峻峰，王洪志，等.大孔吸附树脂在延胡索生物碱提取分离中的应用[J].中草药，2002，33（1）：37-38.

[4] PANYE G F，SHULER M L. Application of adsorbent amberlite XAD-4 and XAD-7 in extraction and separation of indole alkaloid[J]. Biotechnology and Bioengineering，1988，31（6）：922.

[5] 刘楠楠.白屈菜总生物碱提取、安全性评价及体外抑菌作用研究[D].长春：吉林农业大学，2008.