miRNA―363在甲状腺癌中表达变化的研究

【摘要】 目的：探讨微小RNA（miRNA）-363在正常人和甲状腺癌患者血清、甲状腺癌组织及正常癌旁组织中的表达。方法：采用实时荧光定量PCR方法检测miRNA-363在正常人和甲状腺癌患者血清中的含量，并检测甲状腺癌组织和正常癌旁组织miRNA-363含量。结果：miRNA-363在甲状腺癌患者血清及甲状腺癌组织中表达均下降，差异均有统计学意义（P

【关键词】 甲状腺癌； 微小RNA-363； 荧光实时定量聚合酶链反应

中图分类号 R736.1 文献标识码 B 文章编号 1674-6805（2015）29-0017-03

Research of Expression Changes of miRNA-363 in Thyroid Carcinoma/PAN Yi，GAO Yun.//Chinese and Foreign Medical Research，2015，13（29）：17-19

【Abstract】 Objective：To investigate the expression of miRNA-363 in sera of the normal subjects and patients with thyroid carcinoma，and the expression of miRNA-363 in normal thyroid tissues and thyroid carcinoma tissues in patients.Method：The content of miRNA-363 were tested by real-time PCR，and the content of miRNA-363 were tested on normal thyroid tissues and thyroid carcinoma tissues in patients.Result：Compared to the normal subjects，the level of miRNA-363 were significantly decreased in sera of patients with thyroid carcinoma，there were statistically significant differences（P

【Key words】 Thyroid carcinoma； miRNA-363； Real-time PCR

First-author’s address：Jiangyuan Hospital Affiliated to Institute of Nuclear Medicine in Jiangsu Province，Wuxi 214063，China

doi：10.14033/ki.cfmr.2015.29.007

甲状腺癌是目前内分泌系统最常见的恶性肿瘤，约占人体所有肿瘤的1.3%，目前中国的平均甲状腺癌发病率约为7.7/10万，高于世界平均发病率，且呈逐年快速上升趋势[1-2]。目前甲状腺癌的治疗方法主要是外科手术、131I放射治疗、TSH抑制治疗等，部分甲状腺癌患者诊断时已存在远处转移，转移灶不易手术，或存在对放射治疗或化疗不敏感。因此对甲状腺癌的早期诊断、高危人群的普查及新治疗靶点的探索具有现实意义。

miRNA是一类由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码双链RNA分子，其在细胞内具有多种重要的调节作用。miRNA通过直接剪切靶mRNA，或者通过完全/不完全与靶mRNA3'-UTR互补结合抑制靶mRNA的翻译，将蛋白控制在生命活动所需的较低或最佳水平上。这些靶mRNA进一步调控多种生物学行为，如发育的进程、干细胞分化、细胞凋亡、疾病以及肿瘤发生[3]。研究表明miRNA表达谱不仅在区分正常组织来源中发挥重要作用，而且在同类肿瘤的鉴别诊断中也可以发挥重要作用，即在肿瘤组织和正常组织之间，miRNA的表达谱有显著差异[4]。miRNA相关的肿瘤发生通常是由某些特定的miRNA低表达或者不表达，或者某些特定的miRNA高表达所致，其在肿瘤的发生过程中起到癌基因或抑癌基因的作用[5-6]。本研究通过体外检测miRNA-363在甲状腺癌患者和正常人血清以及甲状腺癌组织及正常癌旁组织中的表达变化，从而探讨其是否与甲状腺癌的发生相关，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

1.1.1 标本来源 选取笔者所在医院2015年1-6月手术治疗的30例经病理证实甲状腺癌及正常癌旁组织标本，所有患者术前均未进行针对肿瘤治疗，术后未发现转移。其中女22例，男8例，平均年龄（51.0±10.3）岁，肿瘤平均直径（2.68±1.53）cm。为防止RNA降解，所取癌及癌旁组织（距癌组织>2 cm或对侧甲状腺组织）标本离体后迅速放入液氮保存。正常人血清标本来自于笔者所在医院就诊的志愿者，共30例。

1.1.2 试剂材料 逆转录试剂盒、荧光实时定量PCR试剂盒均为日本TAKARA公司产品。Oligo（dT）16 primer购自TAKARA公司。氯仿、异丙醇、无水乙醇等为国产分析纯。通用引物、miRNA-363引物及探针均由公司美国Applied Biosystems设计并合成。根据has-miRNA-363的序列AUGUCUACCUAUGGCACGUUAA设计并合成（具体序列该公司未公开）。内参U6引物序列：上游引物（F）为5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’；下游引物（R）为5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’。Trizol购自美国Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 血液和甲状腺组织RNA的提取 利用Trizol方法提取血液和组织总RAN，组织样本先采用液氮研磨法磨成粉末。在样本中加入相应量的Trizol裂解细胞，取细胞裂解液1 ml，加入氯仿200 μl颠倒混匀，室温孵育5 min，4 ℃ 12 000转离心15 min，取上清，加入异丙醇500 μl，混匀并室温孵育5 min，4℃ 12 000转离心10 min。弃上清，加入无水乙醇1 ml，4 ℃ 12 000转离心10 min。重复上一步骤，弃上清，37 ℃孵育5 min，加入DEPC水30 μl充分溶解RNA沉淀。吸取RNA样品2 μl加入798 μl DEPC水中，于紫外分光光度计测量OD260和OD280处吸光度值，根据OD260值计算RNA浓度，并根据OD260和OD280比值评估RNA质量，比值在1.8～2.0之间认为RNA质量。样品放入-80 ℃保存至使用。

1.2.2 cDNA的合成 逆转录-聚合酶联反应（RT-PCR）使用TaKaRa试剂。反应体系包括RNA样品溶液2.5 μg，Oligo（dT）16 primer 2 μl，dNTP Mixture 1 μl（含dATP、dTTP、dGTP和dCTP各10 mM），用DEPC水补足总体积至12 μl。PCR仪内65 ℃反应5 min后冰育2 min。加入5×First-Strand Buffer 4 μl，0.1M DTT 2 μl，0.5 μl M-MLV RT（100 units），PCR仪内37 ℃ 5 min，70 ℃ 15 min，产物即为cDNA。

1.2.3 实时荧光定量（Real-time）PCR 每孔反应体系为20 μl，包括2 μl逆转录产物，2 μl All-in-One miRNA qPCR Primer，2 μl Universal Adaptor PCR Primer，10 μl体系混合物和4 μl去离子水。反应体系在PCR仪上温度设定为：95 ℃ 10 min，95 ℃ 10 s、Tm-2 ℃ 20、72 ℃ 30 s 40个循环。实验重复3次。

1.2.4 数据分析 以U6snRNA作为内参，以2-CT法计算相对表达量（RR值），CT=（CT目的-CT内参）实验

-（CT目的-CT内参）对照。RR值反映甲状腺癌患者与正常人血清，甲状腺癌组织与正常癌旁组织miRNA-363表达水平的差异。RR>1为miRNA-363高表达（表达上调），RR

1.3 统计学处理

采用SPSS 17.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，比较采用t检验，P

2 结果

2.1 miRNA-363在正常人与甲状腺癌患者血清中的表达

选定荧光信号阈强度后，统计出miRNA-363达到荧光阈强度所需循环数值（CT），根据公式计算出正常人和甲状腺癌患者血清miRNA-363的相对表达量（RR值）。其RR值分别为：（1.07±0.11）、（0.68±0.11）。与正常人血清表达量相比，miRNA-363在甲状腺癌患者血清中的表达下降，且差异有统计学意义（P

2.2 miRNA-363在正常癌旁组织与甲状腺癌组织中的表达

选定荧光信号阈强度后，统计出miRNA-363达到荧光阈强度所需循环数（CT）值，根据公式计算出癌旁组织与癌组织miRNA-363的相对表达量（RR值）。其RR值分别为：（1.13±0.13）、（0.32±0.07）。与正常癌旁组织表达量相比，miRNA-363在甲状腺癌组织中的表达下降，且差异有统计学意义（P

3 讨论

miRNA通过其与目标mRNA分子的3'端非编码区域互补导致该mRNA分子的翻译受到抑制，在调控基因表达和肿瘤的发生、发展中发挥重要作用。新的研究表明，癌症的形成与miRNA对致癌和抑癌基因的调控有关，因此miRNA在所有恶性肿瘤的发病机制、早期诊断以及寻求新的治疗靶点的研究中意义重大[7]。多种miRNA，如miRNA-21、miRNA-125b、miRNA-146等，在甲状腺癌中过度表达或低表达，在甲状腺癌的发生发展过程中起重要作用[8-9]。miRNA作为癌基因或抑癌基因作用的确有望在基因水平上应用RNAi、人工合成Dicer类似物、反义核酸方法对恶性肿瘤进行生物治疗，使表达异常的基因或蛋白恢复正常。miRNA的出现为甲状腺癌的诊断、治疗提供了新的思路和前景，在相同的肿瘤中miRNA的表达不尽相同，这也进一步说明miRNA对肿瘤发展过程的影响。

有研究报道，在肝癌细胞miRNA-363可下调S1PR1的表达而抑制肝癌细胞的增殖。同时抑制其下游ERK、STAT3的活化，并抑制其下游PDGF-A、PDGF-B、MCL-1及Bcl-xl的表达促进细胞凋亡，因此miRNA-363被认为是肝癌相关的抑癌基因[10]。但目前尚未有miRNA-363在甲状腺癌中相关作用的报道。

本研究统计了30例甲状腺癌患者和正常人血清、癌组织和正常癌旁组织miRNA-363的表达差异。研究中Real Time PCR以U6snRNA（U6）作为内参。患者血清中miRNA-363的RR值为（0.68±0.11），癌组织RR值为（0.32±0.07）。本研究发现，miRAN-363在甲状腺癌症患者血清中的含量较正常人血清中含量下调，而甲状腺癌组织中miRNA-363的表达较癌旁组织明显下调。这提示miRNA-363可能与甲状腺癌的发生有关，其很有可能具有抑癌基因作用，并可能作为甲状腺癌的一个血清标志物，为进一步研究miRNA-363在甲状腺癌中的作用机制奠定了实验基础。

参考文献

[1] Shirazi H A，Hedayati M，Daneshpour M S，et al.Analysis of loss of heterozygosity effect on thyroid tumor with oxyphilia cell locus in familial non medullary thyroid carcinoma in Iranian families[J].Indian J Hum Genet，2012，18（3）：340-343.

[2]孙嘉伟，许晓君，蔡秋茂，等.中国甲状腺癌发病趋势分析[J].中国肿瘤，2013，22（9）：690-693.

[3] Bartel D P.MicroRNAs：genomics， biogenesis，mechanism，and function[J].Cell，2004，116（2）：281-297.

[4] Hampton T.MicroRNAs linked to pancreatic cancer[J].JAMA，2007，297（9）：937.

[5] Zhu S，Si M L，Wu H，et al.MicroRNA-21 targets the tumor suppressor gene tropomyosin 1（TPM1）[J].Biol Chem，2007，282（19）：14328-14336.

[6] Hammond S M.MicroRNAs as oncogenes[J].Curr Opin Genet Dev，2006，16（1）：4-9.

[7] Vriens M R，Weng J，Suh L，et al.MicroRNA expression profiling is a potential diagnostic tool for thyroid cancer[J].Cancer，2012，118（13）：3426-3432.

[8] Keutgen X M，Filicori F，Crowley M J，et al.A panel of four miRNAs accurately differentiates malignant from benign indeterminate thyroid lesions on fine needle aspiration[J].Clin Cancer Res，2012，18（7）：2032-2038.

[9] Pallante P，Visone R，Croce C M，et al.Deregulation of microRNA expression in follicular-cell-derived human thyroid carcinomas[J].Endocr Relat Cancers，2010，17（1）：F91-104.

[10] Zhou P，Huang G，Zhao Y，et al.MicroRNA-363-mediated downregulation of S1PR1 suppresses the proliferation of hepatocellular carcinoma cells[J].Cell Signal，2014，26（6）：1347-1354.

（收稿日期：2015-06-14） （编辑：李越娜）