丛枝菌根真菌与哈茨木霉菌合用对连作丹参生长及质量的影响

[摘要]该文探讨田间条件下丛枝菌根真菌（AMF）与哈茨木霉菌合用对丹参生长及质量的影响。采用田间小区试验来进行研究，使用HPLC测定丹参地上部分和地下部分有效成分含量，通过形态观察并计算根部发病率，并结合方差统计学方法对各指标的测定结果进行分析。结果显示，单独接种AMF以及AMF与哈茨木霉菌合用能够有效的降低连作丹参根部病害的发生率，其中AMF与哈茨木霉菌合用效果更佳，比CK组降低了61.50%。几种处理对丹参生物量影响没有显著差异，但都能提高丹参根部各种有效成分的含量。单独接种AMF以及AMF+哈茨木霉都能显著提高丹参根中丹酚酸B 的含量（P

[关键词]丹参；丛枝菌根真菌；哈茨木霉菌；HPLC；含量测定

丹参Salvia miltiorrhiza Bge.，俗称活血根，是世界公认的治疗心脑血管病的首选药物之一，年需求量15 000 t左右，是栽培面积较大的药材之一，其主要栽培地区为四川、陕西和山东。对四川、陕西地区调查结果表明连作加剧地下根部病害的发生，2～4年连作地块的发病率都高于61%[1]。本课题组对山东莱芜栽培丹参病害进行调查，也发现三年生或者重茬丹参根部病害的发生率达到了60%～70%。丹参根部病害传播蔓延较快，染病后的丹参植株长势衰弱，严重时地上部分枯死，根的木质部完全腐烂成黑褐色，产量显著降低，并且外观性状也不符合药用要求。

已有研究报道表明栽培丹参病害的发生与多种病原菌有关[2]，且属于土传病害，目前采用化学农药防效甚微。利用土壤有益微生物菌剂，快速恢复土壤微生态平衡是解决中药材土传病害的最佳选择[3]。目前的研究表明丛枝菌根真菌、木霉菌、枯草芽孢杆菌以及假单胞菌等对于土传病害都具有防治效果[4-8]。本课题组前期的研究表明丛枝菌根真菌能降低丹参根部病害的发生。但是，对于多种致病菌复合侵染的药用植物，采用单一生防菌菌株适应性差、环境依赖性强、需菌量大且防治效果偏低，有时效果并不明显[9]。基于此，本文在前期研究的基础上，研究AM菌+哈茨木霉菌对连作丹参发病率、生长及几种有效成分含量影响，为应用生防菌来防治连作丹参病害提高药材品质提供科学参考和依据。

1材料

供试AM菌Glomus versiforme （Karsten） Berch由三叶草Trifolium repens L.扩繁，用其根段、菌丝体、孢子及其混合物作为菌剂。哈茨木霉菌Trichodema harzianum购自美国拜沃公司。

Waters 2695 HPLC系统（自动进样器），Waters 2996 PDA检测器；数据处理机：Waters 色谱工作站。乙腈（色谱纯）、磷酸（分析纯），甲醇（色谱纯）。

对照品：丹参素（批号 1103-110101）、迷迭香酸（批号 M24-110421）、丹酚酸B（批号1022-101019）、二氢丹参酮（批号 E06-110116）、隐丹参酮（批号 Y53-110616）、丹参酮Ⅰ（批号 1428-070321）、丹参酮ⅡA（批号 1067-080314），由江西本草天工科技有限责任公司提供。

2方法

2.1田间试验处理

试验在山东莱芜白花丹参基地上进行。试验地为连作3年的丹参地块，为沙壤土。实验地设置4个处理：G. versiforme处理组（AMF组），哈茨木霉菌处理组，G. versiforme与哈茨木霉菌合用处理组，CK对照组。小区设置为随机区组排列，重复数为3次，共计12个小区，小区面积8 m2。

将G. versiforme菌剂以 100 g/钵分别放入营养钵内，对照则加入等量的灭菌接种物，并与钵中土壤混匀后播种。将该钵放入塑料大棚内，待丹参6个月大，幼苗长至 3～5片真叶期开始移栽并进行菌根侵染率的检测。哈茨木霉菌按照说明书在移栽时采用土壤穴施处理。以发病株数占总株数的百分率为发病率。

将采挖6个月的新鲜丹参去泥沙，在阴凉处阴干。采用天平分别称量地上部分和地下部分的干重，进行统计分析。

2.2有效成分含量测定方法

2.2.1 对照品制备 精密称取丹参素1.02 mg、迷迭香酸4.07 mg、丹酚酸B 6.16 mg、二氢丹参酮1.01 mg、隐丹参酮2.40 mg、丹参酮Ⅰ 1.44 mg、丹参酮ⅡA 2.43 mg，分别置10 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解并加甲醇至刻度，制得各对照品储备液。

2.2.2 供试品制备 地上部分供试品制备按照李辉[10]方法进行。地下部分供试品测定方法参考《中国药典》（2010年版一部）（附录ⅥD） [11]进行。

2.2. 3 色谱条件 色谱柱：SGE ENDURO C18 （4.6 mm×250 mm， 5 μm）；流动相A为乙腈，B为含0.1%磷酸溶液，梯度洗脱程序：0～15 min，25%A；15～16 min，25%～40%A；16～18 min，40%～50%A；18～55 min，50%～75%A；55～56 min，75%～25%A；柱温 30 ℃；流速 1 mL・min-1；进样量 5 μL；检测波长 280 nm。

2.2.4 线性关系考察 精密吸取2.2.1中的对照品溶液各3，6，9，12，15，18 μL，置于10 mL量瓶中，加75%甲醇至刻度，摇匀。精密吸取20 μL，分别进样，按2.2.3的色谱条件测定峰面积积分值。以质量浓度（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程及相关系数，见表 1。

2.3数据处理

采用SPSS 17.0 进行方差分析，采用Duncan 新复极差方法检验不同处理之间的差异显著性（P

3结果与分析

3.1生防菌对丹参发病率的影响

单独接种AMF以及AMF+哈茨木霉菌合用能够显著减低连作丹参的发病率，其中对照组、单独施加AMF、哈茨木霉及AMF+哈茨木霉的发病率分别为82.78%，46.42%，85.10%，21.28%，其中AMF+哈茨木霉菌联合使用对病害的抑制作用最显著（P

3.2生防菌对丹参生物量的影响

与对照组相比，各个处理组都对连作丹参地上部分和地下部分的干重影响差异不显著，见表2。

3.3生防菌对丹参地上部分有效成分的影响

与对照组相比，3种处理均能显著降低丹参地上部分丹参素的含量（P

3.4生防菌对丹参地下部分有效成分的影响

不同处理对连作丹参地下部分有效成分的含量影响均有促进作用，水溶性成分见表 4，脂溶性成分见表 5。对水溶性成分，单独接种AMF以及AMF+哈茨木霉都能显著提高丹参根中丹酚酸B 的含量（P

对于脂溶性成分，接种AMF以及AMF+哈茨木霉都能显著提高丹参根中隐丹参酮的含量，都提高月30.67%，单独接种哈次木霉与对照组之间没有显著性差异；AMF处理组还能显著提高丹参酮I，丹参酮ⅡA含量（P

4讨论

4.1对连作丹参根部病害的影响

目前研究表明单个微生物因子在环境中发挥功效的不稳定性，因此人们越来越多地把注意力集中

到利用多个生物因子构成的多功能菌群协同作用发挥生态效应的研究上。本实验结果表明单独接种AMF以及AMF+哈茨木霉菌合用都能够显著减低连作丹参的发病率，但是 AMF+哈茨木霉菌使用作用更强。究其原因是由于哈茨木霉菌和AMF抗土传病害的机制有些不同[12]。木霉菌具有分泌抗生素以及重寄生作用抗病机制，这种抗病机制AMF不具备，因此能够增强AMF的抗病作用[13]。许艳丽、张良等[14-15]研究也表明不同生防菌的抗病机制有交叉，利用抗病机制有交叉的生防菌复配协同抗病，发挥各自的优势和协同作用，增强防治效果。另外，本实验结果表明单独接种哈茨木霉对丹参发病率没有显著的影响，分析原因可能是由于田间实验环境条件比较复杂，影响了木霉的防治效果。

4.2对连作丹参质量的影响

随着市场需求的增加，药用植物连作现象越来越多，连作引起丹参的根部病害加重，根部产生畸形，裂根等现象，并且使得有效成分含量降低，连作障碍严重影响了丹参的药材品质和功效[1]。本实验结果表明，接种AMF以及哈茨木霉菌对丹参植株地上部分有效成分含量的提高作用不明显，只有接种哈茨木霉能提高地上部分丹酚酸B的含量，而对于丹参素，各处理组均有降低的作用。但是，单独接种AMF以及AM+哈茨木霉菌处理组对地下部分各有效成分的含量都有所提高，对连作丹参药材质量提高起到积极的作用。

4.3提高有效成分含量与增强植物抗病性之间的关系分析

有研究表明，丹参中丹参酮类及酚酸类物质都具有广谱的抗菌作用，尤其是对根部病害的病原菌有一定的抑制作用[16]。本实验结果表明单独接种AMF以及AMF+哈茨木霉能增加丹参中有效成分的积累，从而增强抗病性。另外酚酸类物质还能够活化土壤中难溶性的养分，例如矿物中的磷、钾、铁等营养元素[17]，从而有利于植物对抗由于根系缺乏营养元素导致的病虫害[18]。所以单独接种AMF以及AMF+哈茨木霉使用对增强连作丹参抗病性和提高其有效成分含量效果最显著。

综上所述，单独接种AMF以及AMF+哈茨木霉能够有效减低连作丹参病害的发生率，提高丹参根部有效成分含量，从而提高连作丹参药材的品质，尤其是AMF和哈茨木霉联合使用，效果更为显著。因此，在生产实践中利用不同微生物的抗病机制的协同互补，开发和使用二元或者多元复合生防菌剂是十分有意义的。

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Effect of Glomus versiforme and Trichodema harzianum on growth and

quality of Salvia miltiorrhiza

WANG Xue1， CHEN Mei-lan1， YANG Guang1，2， LI Xiao-ming1， LI Peng-ying1， CHEN Min1*

（1.State Key Laboratory of Dao-di Herbs， National Resource Center for Chinese Materia Medica，

China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China；

2.College of Resources Science & Technology， Beijing Normal University， Beijing 100875， China）

[Abstract] The present study aimed to investigate the effect of Glomus versiforme and Trichodema harzianum on the growth and quality of Salvia miltiorrhiza continuous cropping under field conditions. The field plot experiment was conducted， these active components in the plant were analyzed by HPLC， the root diseases incidence rate of S. miltiorrhiza determined by observation and counting，and relative parameters were measured. The data was statistically processed. The result showed that inoculation of G. versiforme and combined inoculation of G. versiforme with T. harzianum significantly decreased the root diseases incidence rate of S. miltiorrhiza， and combined inoculation of G. versiforme with T. harzianum was better than other treatments. All treatments improved accumulation of active ingredients in root. Inoculation of G. versiforme and combined inoculation of G. versiforme with T. harzianum significantly increased the content of salvianolic acid B and cryptotanshinone of root （P< 0.05）， Inoculation of G. versiforme， T. harzianum and combined inoculation of G. versiforme with T. harzianum significantly enhanced the content of tanshinone I and tanshinoneⅡA of the root （P

[Key words] Salvia miltiorrhiza； Arbuscular mycorrhizal； Trichodema harzianum； HPLC； continuous cropping

doi：10.4268/cjcmm20140906