DNA损伤修复体系研究

有实验表明在野生型细胞中加入PARP1抑制剂处理24h之后不会发生显著地细胞存活降低[23]，即在HR损伤修复功能正常时，SSBs被代偿修复之后细胞DNA不会明显受损。但在brca缺陷型细胞中，由于该基因的缺失造成HR损伤修复途径无法正常行使功能，SSBs将转化为复制偶联DBSs而大量积累，最终引起细胞凋亡。但随着研究的深入，发现该作用发生的主导机制与PARP抑制剂导致PARP1在DNA修复过程中滞留于DNA损伤处，进而导致可由BRCA作用解除的复制叉阻滞，或PARP对同源重组修复具有直接的催化作用[24]有关。但无论是什么机制在起作用，PARP抑制剂在brca缺陷型细胞中合成致死作用的明显效果已让人们迫不及待的将这项理论结果实践于临床。PARP抑制剂在以哺乳类模式生物为对象的试验中已初见成效，但也有研究显示brca1缺陷型细胞可能通过二次突变或删除、沉默53BP1等方式来避免与parp合成致死。在53BP1耗竭型细胞中，RAD51将会通过RNF8进行非BRCA1依赖性,不引起RPA（ReplicationproteinA）集结和磷酸化的损伤应答和修复，这也称为合成存活现象[25]。RNF8抑制剂被认为可以在brca突变，53BP1低表达的癌细胞中初步消除合成存活现象，但是否会引起肿瘤细胞启动其他旁路机制还有待研究。PARP抑制剂也可能会诱导brca2缺陷型细胞进行次级基因内删除，以产生新的有HR能力的brca2亚型最终获得对PARP抑制剂的抗性[26]。针对这些机制的研究还在不断深入的过程中。

p53相关的合成致死作用

p53是已知最重要的抑癌基因之一，50%~70%的卵巢癌，大肠癌及头颈癌病例可检测出p53的缺失或突变，其稳定和活化由翻译后修饰机制精确调控[27]。作为重要的转录因子，p53在多项细胞调节通路中起着重要作用：受上游激酶系统PI3-kinase/Akt控制其四聚体N端激活结构域，DNA连接结构域和C端四聚体化结构域能通过转录活化手段正调控凋亡相关基因BAX（BCL-2associatedXprotein），PUMA（p53upregulatedmodulatorofapoptosis）等的表达及负调控抑制凋亡的BCL-2（B-celllymphoma2），存活素等作用于凋亡机制[28,29,30]；对细胞的生存压力变化进行应答，如：通过调控谷胱甘肽过氧化物酶（GPX），醛脱氢酶（ALDH）等的表达对低水平氧化压力进行反应[31]。p53的合成致死主要有赖于其上调p21cip1及GADD45表达，抑制cyclinB/CDK2复合物作用并造成cyclinE/CDK2复合物失去磷酸化pRb的能力[32,33]，非磷酸化pRb将保持与E2F结合，以pRb/E2F复合物形式稳定存在造成细胞阻滞S期，G2期[34]的DNA损伤检查调控，p53磷酸化蛋白质的聚集是细胞阻滞G1期的主要特征。细胞周期检查点由感受器、中介因子、转导因子和效应器四部分构成，其中感受器以PIKKs（Phosphatidylinositol-3-kinaselikeproteinkinases）家族为主，包括主要参与DSBs修复的ATM及参与SSBs修复的ATR[35]。效应器种类众多，本质多为激酶类功能蛋白，以调节CDK的Cdc25家族为代表，其中包括Chk1，Chk2及被p38在下游激活的MK2（MAPKAP-K2）受体激酶。p38MAPK-MK2途径为细胞的生存压力感应途径。毒素侵害，渗透压改变或受到热冲击等可启动p38-MK2途径，其激活有赖于经典的损伤反应途径ATM-Chk2或ATR-Chk1的活化[36]。经典的DNA损伤应答系统如图一。p53突变细胞由于检查点功能缺陷，会形成DNA损伤的复制偶联扩增并不能有效地进行受损细胞的检查阻滞，这最终会导致细胞恶变。而在p53突变肿瘤细胞中对周期损伤检查通路中的其他重要位点如atm/atr的表达进行阻断将达到理想的合成致死效果。虽然已知干预ATR-Chk1通路易造成机制不明的副作用或次生恶变，但Chk2及MK的阻断均可于p53突变型癌细胞中引发合成致死作用[37]，具体可通过Chk抑制剂处理实现。我们课题组前期开展了一系列有关自杀基因系统HSV-tk/GCV作用于p53野生型乳腺癌细胞系MCF-7的实验，希望找出该疗法在肿瘤细胞中的具体杀伤机制。通过分析核酸及蛋白表达，发现其通过p53依赖上调p21cip1途径抑制cyclinE/CDK2作用，使肿瘤细胞周期阻滞S期。说明MCF-7细胞在抵御GCVTP施加的生存压力时，p53介导的G1/S周期阻滞是细胞赖以生存的重要机制。目前我们感兴趣的是，将自杀基因系统HSV-tk/GCV用于p53缺陷型肿瘤细胞是否会如我们预期的产生理想的合成致死效果，还是会促使细胞通过其他平行的非p53依赖机制代偿缺陷，出现合成致死的逃避现象。对自杀基因系统HSV-tk/GCV作用于p53缺陷型肿瘤细胞引发的具体分子机制的研究，将为合成致死作用的深入和恶性肿瘤的临床治疗起到积极作用。

错配修复中的合成致死作用

与错配修复相关的功能基因主要有：MLH1，MSH2，MSH6和PMS2[38,39]。一般认为这些基因的突变会导致MMR缺陷型细胞的产生，这种细胞的突变率是正常细胞的100~1000倍。经典的MMR途径中有两种主要的异二聚体功能蛋白——MutS和MutL。错配修复的经典途径为：MutS结合错配位点并募集中介分子MutL，MutS/MutL复合体以ATP为能量驱动向下游滑动，遇到单链缺口时MutS/MutL复合体便通过结合辅助蛋白PCNA（ProliferatingCellNuclearAntigen），RFC（replicationfactorC）等固定在缺口处并由核酸外切酶EXO1，DNA聚合酶及连接酶相继作用完成修复[40,41]。上述复制偶联损伤引起的MMR与由外界药物和化学制剂引发的MMR组成完整的错配修复。由外界药物或经化学诱变剂处理的细胞中MMR途径的激活伴随细胞周期检测途径（如ATM/ATR依赖型细胞捕获）的活化[42]。可见，错配修复与周期检查机制的密切协作。在MMR缺陷型细胞中利用Chk抑制剂，CDK抑制剂等阻遏周期检测途径很可能会对肿瘤细胞起到可观的杀伤效果。由PINK1（PTEN-inducedputativekinase1）抑制剂会引起MMR缺陷型细胞出现大量氧化性损伤这一现象，发现MSH2、MSH6或MLH1功能丧失而形成的MMR缺陷细胞会因PINK1基因的沉默而发生合成致死作用。目前有关MSH2缺陷转移性结肠直肠癌（MSH2-deficientmetastaticcolorectalcancer，MESH）的合成致死研究已进入临床试验阶段。通过对不同种错配修复相关基因缺陷的细胞进行分析，发现它们的致死途径并不完全相同，如用制斑素和DNAβ聚合酶处理MSH2缺陷型细胞和MLH1缺陷型细胞时凋亡率会出现显著差异[43]，更具体的机制还有待深入研究。

合成致死网络的研究合成致死作用的研究

以DNA损伤修复系统为背景，该系统由众多分工不同的抑癌基因和癌基因产物构成，其中补充功能性的蛋白质，如：磷酸化酶，乙酰化酶等完善整个体系。在Masafumi等[44]对c-Myc过表达细胞系中合成致死位点的筛选中，得到了49个可信位点。其中大部分位点的突变或抑制将引起损伤增加并积累，剩余的与蛋白质的翻译后修饰(以组蛋白乙酰化为主)及转录延长等调控机制相关，如TRRAP和BRD4。动物活体内实验也发现了潜在的合成致死位点，CSNK1e。这项研究提示我们癌基因与抑癌基因在合成致死作用中都具有重要的意义。ZhenyuYang等[45]在近期对两种酵母的基因群进行分析之后，对合成致死基因网络给出结论：细胞中各种功能基因形成平行/汇聚的网络，当某一组平行通路中的各条路径发生不少于一个的功能基因突变时，就可能引起合成致死。这使我们开始重视合成致死机制可能存在的规律性，对合成致死位点及基于合成致死作用的肿瘤治疗药物的筛选提供了方向。

展望

合成致死作用是以DNA损伤反应及修复系统为背景，普遍存在于各类生物细胞中的一种调控机制，理论基础为多个基因同时突变或受到损伤时对DNA损伤反应、修复过程会造成更加全面的阻断，造成DNA损伤积累而引发细胞凋亡。由于DNA损伤反应、修复网络的旁路众多，复杂性高及调控的规律还尚不明确，目前相关研究还未广泛实践于临床治疗。合成致死作用可针对特定基因缺陷型，如Rb，p53，BRCA和Myc等缺陷引起的肿瘤开展治疗，预期具有针对性好，副作用小等优势。我们期待在不久的将来，合成致死作用将广泛应用于恶性肿瘤的临床治疗中，帮助人类攻克癌症治疗这一难题。

作者：薛蔚雯 任自敬 焦春红 曾赵军