阳春砂1?去氧?D?木酮糖?5?磷酸还原异构酶基因的克隆及表达分析

作者：杨锦芬 阿迪卡利 陈蔚文 何国振 ,徐晖 何瑞 詹若挺

【摘要】 【目的】克隆阳春砂萜类生物合成途径的上游关键酶——1?去氧?d?木酮糖?5?磷酸还原异构酶(1?deoxy?d?xylulose?5?phosphate reductoisomerase, dxr)(ec:1?1?1?267)的编码基因;分析基因的功能及其在阳春砂不同组织中的表达。【方法】通过基于逆转录—聚合酶链反应(rt?pcr)的方法从阳春砂叶片中获得编码dxr的cdna全长序列,克隆基因编码区;用生物信息学的方法对其编码蛋白进行相似性检索和功能分析;用半定量rt?pcr法比较基因在阳春砂不同组织中的表达差异。【结果】获得了全长1 749 bp的编码阳春砂dxr的cdna序列,命名为avdxr1(genbank登记号：fj459894)。avdxr1编码的蛋白与其他植物来源的dxr有很高相似性,含有烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nadph)结合基序和dxr活性位点基序,n?端有叶绿体靶向转运肽。保守功能结构域的分析结果表明avdxr1属于1?去氧?d?木酮糖?5?磷酸还原酶家族。avdxr1在包括茎、根、果皮和种子团的广泛组织中表达,且在这些组织中的表达量均高于在叶片中的表达。【结论】avdxr1基因是阳春砂dxr的编码基因,该基因在阳春砂的叶、茎、根、果皮和种子团中广泛表达。

【关键词】 阳春砂/生长和发育;萜类化合物;基因克隆;基因表达

砂仁化湿行气的主要药效物质为挥发油,其主要成分为萜类化合物[1-3]。紫杉醇、青蒿素等药效确切的萜类化合物的研究及其临床应用使萜类化合物成为药用植物次生代谢研究领域的热点之一,随着分子生物学的发展,萜类化合物生物合成途径相关酶类的编码基因也不断被克隆和研究[4-6]。

植物萜类化合物生物合成的上游途径已基本清楚,甲羟戊酸途径(mevalonate pathway,简称mva途径)和丙酮酸/磷酸甘油醛途径(pyruvate/glyceraldehyde?3?phosphate pathway,简称dxp途径)是萜类化合物生物合成的2条途径,mva途径在细胞质中进行,而dxp途径发生在质体中[7-10]。1?去氧?d?木酮糖?5?磷酸还原异构酶(1?deoxy?d?xylulose?5?phosphate reductoisomerase, dxr)(ec:1?1?1?267)是dxp途径的关键酶[10]。dxr基因已经从薄荷mentha x piperita[11]、玉米zea mays[12]、银杏ginkgo biloba[13]、喜树camptotheca acuminata[14]和丹参salvia miltiorrhiza[15]等植物中克隆得到。为了保护阳春砂的基因资源,进一步探明阳春砂药效物质萜类成分生物合成的调控机制,本研究采用简并引物逆转录—聚合酶链反应(rt?pcr)结合cdna末端快速扩增(race)的方法,从阳春砂叶片中克隆编码dxr的基因,通过生物信息学分析鉴定所获基因,采用半定量rt?pcr法分析基因在不同组织中的表达差异,现将结果报道如下。

1材料与方法

1?1植物材料用于基因克隆的阳春砂引种自广东阳春市砂仁试验示范场,栽种于广州中医药大学大学城校区药王山。用于基因表达分析的阳春砂幼苗培养方法：取阳春砂种子用细砂搓去假种皮,浸种24 h后播种于盛有营养土与粗砂(比例为3∶1)为基质的育苗盆中室温光照培养,待幼苗长出2～4片真叶后间苗,每盆(直径12 cm)留取生长一致的苗2～3株,待苗龄约6个月(长出7～9片真叶)时取第1位完全展开叶、茎和根用于基因表达分析。阳春砂成熟果实取自阳春春湾,液氮速冻后-70℃保存备用。

2010年第27卷广州中医药大学学报杨锦芬，等.阳春砂1?去氧?d?木酮糖?5?磷酸还原异构酶基因的克隆及表达分析第5期1?2主要试剂植物rna提取试剂盒(北京普利莱基因技术公司)，primescript rt?pcr kit、1st strand cdna synthesis kit、ex taq dna聚合酶、la taq dna聚合酶、克隆载体pmd18?t(宝生物工程大连有限公司)，柱式植物rnaout试剂盒(北京天泽基因公司)，克隆载体pgem?t(美国promega公司)，smart race kit(美国clontech公司)，大肠杆菌e?coli菌株dh5α(本实验室保存)，taq dna聚合酶、dna回收试剂盒(北京赛百盛生物工程公司)。引物由上海生工生物工程公司合成，测序由上海生工生物工程公司和上海英潍捷基(invitrogen)公司完成。

1?3目的基因核心片段的扩增

1?3?1简并引物设计在genbank上检索来源于单子叶植物的dxr序列,获得水稻、玉米、大麦和油棕的dxr序列(登记号分别为af367205、aj297566、aj583446和ay583784)。采用omiga 2?0软件对上述序列进行比对,根据其高度同源区域设计2对用于嵌套pcr的简并引物ad1、ad3和ad2、ad4,引物序列见表1。

1?3?2总rna的提取取0?1 g新鲜叶片,用植物rna提取试剂盒,参照说明书的方法提取总rna。用10 g/l琼脂糖凝胶电泳检查rna的完整性,用dna/rna calculator(biorad)测定d260与d280,确定总rna的浓度与纯度。

1?3?3rt?pcr方法取总rna 2 μg,采用prime script rt?pcr kit,参照说明书的方法,以oligo(dt)为引物进行反转录。下一步以反转录产物为模板,以ad1、ad3为引物进行1stpcr。反应体系(20 μl)：5 u/μl ex taq酶 0?1 μl、10倍pcr buffer 2 μl、10 mmol/l 脱氧核苷酸三磷酸(dntp)2 μl、10 μmol/l上游引物 0?75 μl、10 μmol/l下游引物0?75 μl、反转录产物 1?5 μl、灭菌超纯水13 μl。pcr反应程序：94℃变性3 min;94℃变性0?5 min,57℃退火0?5 min,72℃延伸1 min,37个循环;72℃延伸5 min。以引物ad2、ad4进行2nd pcr,模板取1st pcr产物1 μl,退火温度为53℃,其他与1st pcr相同。pcr产物以10 g/l琼脂糖凝胶电泳检测,确认特异条带后,按比例扩大体积至100 μl进行pcr。用dna回收试剂盒,参照说明书的方法回收pcr产物,用相应的简并引物进行测序。

1?3?4核心片段的确认登陆www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/,在genbank中用测序所获序列进行blastn(nucleotide blast)检索,检验所获片段与已知的其他植物dxr序列的相似性。

1?4目的基因cdna全长的获得和编码蛋白分析

1?4?1race引物的设计用于3??race的反转录引物r3以及用于1st pcr和2nd pcr的下游引物r3p1、r3p2见表1。根据1?3?4项获得的核心片段序列和race试剂盒的引物设计要求,设计相应的3??race上游引物ad31、ad32和5??race下游引物ad51、ad52(见表1)。

1?4?23??race以总rna为模板、r3为引物进行反转录,再以r3p1、r3p2为下游引物,分别与目的基因的特异引物ad31、ad32配对,参照1?3?3项下的pcr反应体系及程序,调整相应的退火温度和延伸时间进行嵌套pcr。回收pcr目的片段,连接至pmd18?t载体,热击法[16]转化e.coli dh5α,以pcr检测呈阳性的菌落用载体通用引物测序。

1?4?35??race采用smart race kit,参照说明书的方法进行反转录,再以试剂盒中的upm和nup为上游引物,分别与目的基因的特异引物ad51、ad52配对,进行嵌套pcr。回收pcr目的片段,克隆至pgem?t载体,用载体通用引物测序。

1?4?4cdna全序列的拼接采用omiga 2?0软件,对3??race和5??race的测序结果进行分析,去除载体序列,用genbank的“blast 2 sequences”功能,将3?、5?端序列分别与1?3?4项获得的核心序列进行比对和拼接,获得cdna全长,再用omiga 2?0软件分析其开放阅读框架(orf),翻译成氨基酸序列。用genbank的blastp程序对所获氨基酸序列进行同源检索,初步确认获得的翻译蛋白是否为dxr的同源蛋白及其完整性。

1?4?5编码区的克隆根据获得的cdna全序列中编码区的两侧序列设计引物ado1和ado2(表1),以1?3?3 项获得的反转录产物为模板,用la taq酶进行pcr,扩增编码区全长。将目的片段克隆至pgem?t载体,选2个以上阳性克隆测序。测序后发现编码区不完整,将测序获得的序列与拼接获得的cdna全长进行比对,发现3?端有较大差异,根据差异序列设计引物ad33(表1),再次进行3??race。用此次3??race所获序列进行cdna全长的第2次拼接,据此设计克隆编码区的下游引物ado3(表1),与ado1配对,再次扩增编码区,克隆至pgem?t载体,选2个以上阳性克隆测序,再次检验编码区的完整性。表1阳春砂avdxr1克隆所用引物

1?4?6基因编码蛋白分析及序列提交用dnastar 5?0软件分析目的基因编码蛋白的分子量、等电点等理化性质。登陆hc.ims.u?tokyo.ac.jp/ipsort/,进行亚细胞定位预测。利用genbank的blastp程序对氨基酸序列进行同源检索。用dnaman 5?0软件进行氨基酸序列的多重比对以及系统发育树的绘制。登陆www.ncbi.nlm.nih.gov/structure/cdd/cdd.shtml,利用保守功能域数据库(conserved domain database,cdd)进行蛋白保守功能域的在线预测[17]。登陆www.ncbi.nlm.nih.gov/bankit/,向genbank提交avdxr1的基因序列及其编码的氨基酸序列。

1?5基因表达分析

1?5?1rna提取叶片、根、茎的总rna提取按照1?3?2项下方法进行。果皮和种子团总rna的提取用柱式植物rnaout,参照说明书的方法进行。

1?5?2反转录采用1st strand cdna synthesis kit,参照说明书方法进行。

1?5?3半定量pcr根据芭蕉和三七的18s rrna基因序列(ef376005和d85171)的比对结果,设计引物18sf、18sr(表2),扩增半定量rt?pcr体系的内参照18s rrna。设计引物adr1、adr2(表2),扩增目的基因片段(约450 bp)。以反转录产物为模板进行半定量pcr。反应体系(20 μl)：10倍pcr buffer 2 μl、dye(pcr染料)2 μl,10 mmol/l dntp 1?5 μl、10 μmol/l上游引物 0?5 μl、10 μmol/l下游引物 0?5 μl、5 u/μl taq dna聚合酶 0?2 μl,根据18s rrna的扩增结果调整相应模板的用量,灭菌超纯水补足体积。pcr反应程序：94℃变性2 min;94℃变性0?5 min,55℃退火0?5 min,72℃延伸1 min,29个循环(18s rrna)或32个循环(avdxr1)。每个反应取5 μl pcr产物以1?2 g/l的琼脂糖凝胶电泳比较产物亮度。每个反应重复3次以上。表2avdxr1半定量rt?pcr所用引物

2结果

2?1rna提取结果从阳春砂嫩叶中提取总rna,电泳结果如图1所示,28 s和18 s rrna条带清晰,无dna污染,rna浓度约为1 μg/μl。

amomum villosum leaves2?2avdxr1核心片段的扩增及3??race、5??race结果如图2所示,1st pcr和2nd pcr的结果均获得约450 bp的目的片段。2nd pcr回收产物的测序结果获得444 bp的序列,blastn结果显示该序列与其他植物来源的dxr序列有较高相似性(81%～86%)。

通过3??race获得约700 bp的片段(图3-a)。测序得到以polya结尾的710 bp的序列,blastn结果显示该序列与其他植物来源的dxr序列3?端有较高相似性(69%～78%)。

通过5??race获得约800 bp的片段(图3-b)。测序得到822 bp的序列,blastn结果显示该序列与其他植物来源的dxr序列5’端有较高相似性(74%～80%)。

2?3avdxr1全长cdna的拼接及其编码区的克隆将克隆获得的5?端822 bp、核心片段444 bp与3?端710 bp的序列进行拼接,获得了1 722 bp的序列,命名为avdxr?1722,该序列包含1 419 bp的orf。扩增编码区(图3-c),测序获得1 444 bp的序列,命名为ado?1444。ado?1444的最大orf全长仅1 221 bp,推测ado?1444的编码区未完整。将ado?1444与avdxr?1722进行比对,结果显示两者的序列差异主要在3?端。根据3?端差异序列设计引物ad33,再次扩增avdxr基因的3?端(图4-a),测序得到以polya结尾的581 bp的序列,命名为avdxr3??581。

将5?端序列(822 bp)、ado?1444与avdxr3??581进行拼接,获得1 749 bp的序列,命名为avdxr1?1749。对avdxr1?1749的编码区进行扩增(图4-b),测序获得1 452 bp的插入序列,最大orf的分析结果表明该序列包含了完整的1 416 bp的orf。将此序列与avdxr1?1749进行比对,两者的重合序列完全一致,验证了第2次拼接获得的cdna序列的正确性。

avdxr1?1749包含5?端167 bp的非编码区、1 416 bp的orf和3’端166 bp的非编码区,最后以polya结尾,编码472个氨基酸。avdxr1编码的蛋白分子量为51?41 kd,等电点为6?44。avdxr1蛋白的亚细胞定位预测结果显示其n?端有叶绿体转运肽。向genbank提交阳春砂avdxr1序列及其编码的氨基酸序列,获得序列登记号fj459894。

2?4avdxr1与其他植物dxr蛋白的同源性及系统进化关系blastp检索结果表明,阳春砂avdxr1与来源于其他植物的dxr蛋白有较高同源性。表3列出了avdxr1与其他11个植物dxr蛋白的比对结果,序列相似性达到85%～91%,序列长度也相近。表3avdxr1与其他11个植物dxr蛋白相似性比较

table 3alignments of amino sequence of avdxr1 with dxrs from other 11 plant species

dxr来源科属登记号序列长度/aa序列相似性/%玉米z.mays禾本科,玉米属acg3301247291水稻o.sativa禾本科,稻属bab7860647392近琴巴豆c.stellatopilosus大戟科,巴豆属abo3817746789大麦h.vulgare禾本科,大麦属cae4743848488橡胶树h.brasiliensis大戟科,橡胶树属abd9270247189番茄s.lycopersicum茄科,番茄属aak9606347589胡黄连p.kurrooa玄参科,胡黄连属abc7456647587烟草n.tabacum茄科,烟草属abh0896447389葛藤p.montana豆科,葛属aaq8416846584红豆杉t.media红豆杉科,红豆杉属aau8783647787银杏g.biloba银杏科,银杏属aar9570047785

avdxr1与其他11个植物dxr的系统进化关系分析结果如图5所示,12种dxr的分子进化关系与其来源植物的亲缘关系基本一致,avdxr1与同为单子叶植物来源的玉米、大麦、水稻的dxr有更近的亲缘关系。

avdxr1与3个单子叶植物玉米、大麦和水稻的dxr多重比对结果(图6，彩图见第558页)显示,它们在第46位氨基酸以后的区域均有较高的连续相似性,在它们的n?端含有2个高度保守的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nadph)结合基序,中部含有2个dxr活性位点基序。

2?5avdxr1功能预测cdd是genbank数据库的一部分,通过cdd搜索便可以利用该数据库对目的蛋白进行保守功能域的扫描,从而进行蛋白质功能的预测和家族聚类[17]。用avdxr1的序列进行cdd搜索,结果显示avdxr1蛋白具有prk05447(1?deoxy?d?xylulose?5?phosphate reductoisome rase)功能域,属于1?去氧?d?木酮糖?5?磷酸还原异构酶超级家族(pfam02670：dxp_reductoisom superfamily),带有dxr家族典型的c?端功能结构域(pfam08436∶dxp_ redisom_c superfamily)。

2?6avdxr1半定量rt?pcr结果如图7所示,根据半定量rt?pcr的结果,avdxr1在茎、根、果皮和种子团中的表达量高于在叶片中的表达量。

3讨论

dxr是萜类生物合成2条途径之一——dxp途径的关键酶。它由nadph提供还原力,将1?去氧?d?木酮糖?5?磷酸还原异构酶(1?deoxy?d?xylulose?5?phosphate,dxp)转化为2?甲基赤藓醇?4?磷酸(2?c?methyl?d?erythritol?4?phosphate,mep)[18]。由于dxp也可用于硫胺和吡哆醇的生物合成,mep才是萜类合成的重要前体,因此,此步反应是萜类生物合成dxp途径的“碳流”分支点,也是重要的调控靶点[4]。过量表达dxr的转基因薄荷挥发油含量比野生型提高了50%[19]。在烟草中过量表达来源于蓝藻(synechosystis pcc6803)的dxr基因,提高了多种萜类物质的含量[20]。dxr基因在通过基因工程调控萜类合成方面有良好的应用前景。本研究应用简并引物rt?pcr与race结合的方法,首次从阳春砂叶片中克隆了avdxr1基因,获得全长1 749 bp 的cdna全序列及其编码的包含472个氨基酸的蛋白质序列。

对黄花蒿、玉米等6种植物的dxr分子结构分析表明,不同植物dxr的功能域有着几乎一致的氨基酸组成,具有dxr活性所必须的典型的多肽位点[21],提示来源于不同植物的dxr功能域具有较高的保守性。本研究通过cdd搜索,对克隆获得的阳春砂avdxr1基因的编码蛋白进行了功能预测,结果表明,avdxr1属于1?去氧?d?木酮糖?5?磷酸还原异构酶(dxr)家族。avdxr1蛋白n?端含有的2个nadph结合基序和中部的2个dxr活性位点基序与前人对植物dxr的分子结构分析一致[18]。从多种植物中克隆的dxr基因编码蛋白均具有质体转运肽[11-14],对avdxr1蛋白的亚细胞定位预测结果显示,在其n?端也有叶绿体转运肽,据此判断该基因编码的成熟蛋白定位于质体,在质体行使催化功能,这与dxp合成途径的细胞定位是一致的。通过基于以上生物信息学的分析,初步证明了克隆获得的avdxr1是阳春砂萜类生物合成途径1?去氧?d?木酮糖?5?磷酸还原异构酶的编码基因。

喜树cadxr在茎部的表达量高于叶片与根部的表达量[14]。gbdxr在银杏的多种组织,包括根、茎、叶、果皮和种子中表达,其中在叶片中表达量较低[13]。avdxr1在阳春砂不同组织中的表达分析表明,avdxr1在包括茎、根、果皮和种子团的广泛组织中表达,且在这些组织中的表达量均高于在叶片中的表达。由于果实是阳春砂的重要药用部位,avdxr1在果实中的表达对于阳春砂萜类生物合成的原位调控具有重要意义。

本研究克隆获得了阳春砂avdxr1基因,为进一步分析该基因在萜类生物合成途径中的功能打下基础,为将其应用于萜类药效成分生物合成的基因工程调控提供了依据。

(致谢：广州中医药大学中药资源科学与工程研究中心刘艳、黄琼林、宁鑫、吴睿等研究生参与了植物培养、果实取样的工作,广东阳春市砂仁试验示范场苏景场长提供了阳春砂种苗,特此致谢!)

【参考文献】

[1]刘军民, 刘春玲, 徐鸿华. 砂仁[m].北京:中国中医药出版社,2001：1.

[2] 余竞光, 孙兰, 周立东, 等. 中药砂仁化学成分研究[j].中国中药杂志,1997,22(4):231.

[3] 胡玉兰,张忠义,林敬明. 中药砂仁的化学成分和药理活性研究进展[j].中药材,2005,28(1):72.

[4] 罗永明, 黄璐琦, 刘爱华, 等. 植物萜类化合物的生物合成途径及其关键酶的研究进展[j].江西中医学院学报,2003,15(1):45.

[5] 陈建, 赵德刚. 植物萜类生物合成相关酶类及其编码基因的研究进展[j].分子植物育种,2004,2(6):757.

[6] 陈大华, 叶和春, 李国凤, 等. 植物类异戊二烯代谢途径的分子生物学研究进展[j].植物学报,2000,42(6):551.

[7] lange b m, wilding m r, mccaskilld d, et a1.a family of transketolases that directs isoprenoid biosynthesis via a mevalonate independent pathway[j].proc natl acad sci usa,1998,95(5):2100.

[8] mahmoud s s, croteau r b. metabolic engineering of essential oil yield and composition in mint by altering expression of deoxyxylulose phosphate reductoisomerase and menthofuran synthase[j].proc natl acad sci usa ,2001,98(15):8915.

[9] liu y, wang h, ye h c, et al.advances in the plant isoprenoid biosynthesis pathway and its metabolic engineering[j]. acta botanica sinica,2005,47(7):769.

[10]proteau p j.1?deoxy?d?xylulose?5?phosphate reductoisomerase：an overview[j].bioorgan chem,2004,32(6):482.

[11] lange b m, croteau r. isoprenoid biosynthesis via a mevalonate?independent pathway in plants: cloning and heterologous expression of 1?deoxy?d?xylulose?5?phosphate reductoisomerase from peppermint[j].arch biochem biophys,1999,365(1):170.

[12] hans j, hause b, strack d, et al.cloning,characterization,and immunolocalization of a mycorrhiza?inducible 1?deoxy?d?xylulose?5?phosphate reductoisomerase in arbuscule?containing cells of maize[j].plant physiol,2004,134(2):614.

[13]gong y f, liao z h, chen m, et a1.molecular cloning and characterization of a 1?deoxy?d?xylulose?5?phosphate reductoisomerase gene from ginkgo biloba[j].dna seq,2005,16(2):111.

[14] yao h, gong y, zuo k, et al.molecular cloning,expression profiling and functional analysis of a dxr gene encoding 1?deoxy?d?xylulose?5?phosphate reductoisomerase from camptotheca acuminata[j].j plant physiol,2008,165(2):203.

[15]wu s j, shi m, wu j y. cloning and characterization of 1?deoxy?d?xylulose?5?phosphate reductoisomerase gene for diterpenoid tanshinone biosynthesis in salvia miltiorrhiza hairy roots[j].biotechnol appl biochem,2009,52:89.

[16] sambrook j, russell d .分子克隆实验指南 [m].3版. 北京：科学技术出版社,2002：96.

[17] marchler b a, anderson j b, derbyshire m k, et al. cdd：a conserved domain database for interactive domain family analysis[j].nucleic acids res,2007,35：237.

[18]takahashi s, kuzuyama t, watanabe h, et al. a 1?deoxy?d?xylulose?5?phosphate reductoisomerase catalyzing the formation of 2?c?methyl?d?erythritol?4?phosphate in an alternative nonmevalonate pathway for terpenoid biosynthesis[j].pnas,1998,95:9879.

[19]hasunuma t, takeno s, hayashi s, et al. overexpression of 1?deoxy?d?xylulose?5?phosphate reductoisomerase gene in chloroplast contributes to increment of isoprenoid production[j]. j biosci bioeng,2008 ,105(5):518.

[20] mahmoud s s,croteau r b. metabolic engineering of essential oil yield and composition in mint by altering expression of deoxyxylulose phosphate reductoisomerase and menthofuran synthase[j].proc natl acad sci usa ,2001,98:8915.

[21] 李嵘, 王?粗? 植物萜类合成酶1?脱氧?d?木酮糖?5?磷酸还原异构酶的分子结构特征与功能预测分析[j].植物研究,2007,27(1):59.