低频脉冲电磁场对大鼠骨髓源性内皮祖细胞增殖活性和NO分泌的影响

作者：马彦卓，许旭东，韩凯，李飞，曹艳杰，张荣庆,王海昌

【摘要】 目的： 观察不同作用时间下低频脉冲电磁场对大鼠骨髓源性内皮祖细胞（epcs）增殖活性和no分泌的 影响 . 方法 ： 密度梯度离心法获取大鼠骨髓单个核细胞,培养4 d后收集贴壁细胞，每日给予低频脉冲电磁场干预，磁场强度0.6 mt，频率15 hz. 按作用时间的不同分为对照组（0 h）和磁场作用时间组(0.5，2，4，8 h组)，各组细胞培养及磁场干预3 d后,分别采用mtt比色法测定epcs的增殖活性,流式细胞仪检测细胞周期，griess法检测培养上清中no水平. 结果： 对照组a490 nm为（0.37±0.07）, 0.5 h组（0.37±0.06）, 2 h组（0.40±0.09）与对照组（0.37±0.07）相比差异无统计学意义(p>0.05）；4 h组a490 nm值开始增加［(0.45±0.03） vs （0.37±0.07）; p<0.05］, 8 h组较对照组增加最为明显［（0.49±0.08） vs （0.37±0.07）；p<0.01］. 0.5 h组，2 h组细胞增殖指数pi（s+g2m）％与对照组相比差异无统计学意义(p>0.05），4 h组，8 h组细胞增殖指数与对照组相比差异均有统计学意义（p<0.05）. no分泌随磁场作用时间的延长，其分泌增加. 结论： 低频脉冲电磁场可影响epcs的增殖及no分泌，随着作用时间的延长，细胞增殖及no分泌增加.

【关键词】 电磁场;内皮祖细胞;细胞增殖；一氧化氮

0引言

内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，epcs)作为 治疗 性血管形成的 研究 靶点，已发现其不仅参与血管形成，也参与出生后血管生成［1］. 低频脉冲电磁场作为一种外来干预手段，已发现其可促进内皮细胞修复，促进内皮细胞fgf的分泌，提示低频电磁场对血管形成具有促进作用［2］. 我们采用体外培养大鼠骨髓epcs,观察低频脉冲电磁场不同作用时间下骨髓epcs增殖能力和no分泌的变化及其时效关系,并探讨其相关作用机制，以期寻找一种新的促进血管生成的手段.

1材料和方法

1.1材料健康雄性sd大鼠30只，体质量80～100 g（第四军医大学实验动物中心）；脉冲电磁场发生仪（第四军医大学生物医学工程系）；ficoll淋巴细胞分离液（ 中国 医学 科学 院生物工程医学研究所）；胎牛血清（美国hyclone公司）；血管内皮生长因子(vegf)，成纤维细胞生长因子（bfgf）（澳大利亚cytolab公司）；fitc标记荆豆凝集素ⅰ(fitc?uea?i，美国sigma公司）；dii标记的乙酰化低密度脂蛋白(dii?acldl，美国molecular probe公司）；no试剂盒（南京建成生物工程研究所）；激光共聚焦显微镜（美国bio?rad公司）.

1.2方法

1.2.1epcs的分离、培养与鉴定［2-3］将大鼠颈椎脱臼处死后,取四肢骨用750 ml/l乙醇浸泡10 min，用5 ml注射器抽取培养液冲洗骨髓液,密度梯度离心法获取单个核细胞,将其接种予培养瓶中,在m199培养基(含100 ml/l fbs，vegf 10 μg/l，bfgf 5 μg/l，l?谷氨酰胺300 mg/l，青霉素1×105u/l，链霉素100 mg/l，肝素1.25×104u/l)中培养,差异贴壁法培养4 h后，吸取上清置于新的培养瓶中继续培养4 d. 将培养4 d的细胞消化，接种于盖玻片上，24 h后将细胞爬片行dil?ac?ldl与fitc?uea?i直接免疫荧光双染. 向细胞爬片孔内加10 mg/l dil?ac?ldl，37℃孵育10 h后，细胞爬片经40 g/l多聚甲醛室温固定10 min，pbs漂洗后加入10 mg/l fitc?uea?i并于37℃避光孵育1 h，pbs洗涤同上，晾干后封片，激光共聚焦显微镜观察. fitc?uea?和dii?acldl双染色阳性细胞为正在分化的epcs.

1.2.2实验分组pemfs发生仪频率15 hz,磁感应强度:0～1.4 mt可调，线圈直径 200 mm. 调整两线圈距离至100 mm. 将线圈放置在孵箱中,刺激时将细胞放置在两线圈中间位置. 调整需要的强度和频率,实验分组按磁场强度分为对照组（不加磁场干预），0.2 mt, 0.6 mt和1.0 mt各组,贴壁细胞消化后,每组按每日干预时间的不同随机分成0.5，2，4，8 h各亚组. 即每日各组分别干预0.5，2，4 和8 h，共3 d.

1.2.3细胞活性检测如上述方法收集贴壁细胞并计数. 将等量epcs接种到96孔培养板上,磁场干预3 d后，每孔加5 g/l mtt 20 μl,培养4 h后小心吸弃上清液,每孔加入dmso 150 μl,于微量振荡器充分振荡10 min,使结晶充分溶解,在酶联免疫检测仪上测a490 nm,以空白培养液调零.

1.2.4细胞周期检测用上述方法消化收集贴壁细胞,再将等量epcs接种到6孔板上,磁场干预3 d后，完全培养液以1000 r/min离心5 min后弃上清，加入冰冷的0.1 mol/l pbs以1000 r/min×5 min洗2次后弃上清，加入1 ml生理盐水制成单细胞悬液. 加预冷的无水乙醇2 ml快速混匀，固定细胞、用封口膜封口，4℃下保存1 h后弃固定液，用pbs洗2次（1000 r/min×5 min）后，加入0.1 ml pbs调整细胞密度，并加入1 ml dna荧光染料，室温下避光染色15 min，置流式细胞仪 分析 . 计算 细胞增殖指数(pri). pri=(s+g2/m)/(g0/g1+ s+g2/m)×100%.

1.2.5no分泌检测如上述方法收集贴壁细胞并计数. 将等量epcs接种到96孔培养板上,磁场干预3 d后，吸取上清，用griess法测定培养基中no的稳定代谢产物亚硝酸盐(no2-) 浓度，测定方法按照no试剂盒说明书操作, 在酶联免疫检测仪上测a490 nm值,按公式计算no含量.

统计学处理：各组实验均重复3次. 计量资料以x±s表示, 应用 spss11.0统计软件处理,组间资料比较采用anova,组间两两比较采用lsd?t检验,以p<0.05为差异有统计学意义.

2结果

2.1epcs的培养及鉴定图片培养的epcs有贴壁生长的特性，刚分离出的细胞呈圆形，折光性强（图1a）；培养4 d后，细胞形态多样，为单核，多边形及短梭形（图1b）. 用dii?acldl和fitc?uea?ⅰ对细胞染色后,通过共聚焦显微镜鉴定,此双染色阳性细胞被认为是正在分化的epcs(图2).

a： 圆形单个核细胞； b： 短梭形及多边形细胞.

图1倒置显微镜下内皮祖细胞的形态×200（略）

a： fitc?vea?i染色； b： dil?ac?ldl染色； c： 双染阳性的epc.

图2激光扫描共聚焦显微镜检测内皮祖细胞的表面标志×200（略）

2.2磁场不同作用时间对骨髓epcs增殖活性的 影响 经暴磁培养3 d后，epcs增殖活性0.5 h组为（0.37±0.06），2 h组为（0.40±0.09），与对照组（0.37±0.07）相比较，差异无统计学意义（p>0.05). 4 h组(0.45±0.03)的epcs数量开始增加，与对照组相比较，差异具有统计学意义（p<0.05)，8 h组（0.49±0.08）较对照组增加最为明显.

2.3磁场不同作用时间对骨髓epcs细胞周期的影响经暴磁培养3 d后，反映细胞增殖活力的pri（s+g2m）％，0.5 h组和2 h组与对照组相比差异无统计学意义［(7.80±0.80） vs （7.93±0.57）；（7.77±0.15） vs （7.93±0.57），p>0.05］. 但随着时间的延长，4 h组细胞pri与对照组相比差异有统计学意义［(11.20±2.59） vs （7.93±0.57）；p<0.05］,8 h组细胞pri与对照组相比差异具有统计学意义［(14.70±2.01） vs （7.93±0.57）；p<0.01］.

2.4磁场不同作用时间对骨髓epcs no分泌的影响经暴磁培养3 d后，0.5 h组（3.76±0.98），2 h组（3.87±0.49） 和4 h组(4.13±0.74）与对照组（3.32±0.24）相比差异无统计学意义（p>0.05）；8 h组(5.13±0.65）与对照组相比较差异具有统计学意义(p<0.01).

3讨论

磁场具有多方面的生物效应. 在血管形成方面，已发现脉冲电磁场可促进内皮细胞增殖，加快血管内皮损伤处再内皮化过程，并可促进心梗后血管形成［4-6 ］. tepper等［1］发现低频脉冲电磁场可促进血管新生，并推测这一作用与内皮细胞fgf?2分泌增加有关.

epcs是一类能增殖并分化为血管内皮细胞,是血管形成的前体细胞. 但生理情况下,循环epcs的数量相对较少,尤其在一些病理条件下,epc的数目及活性会下降. hill等［7］和vasa等［8］分别报道冠心病患者循环血中的epc数量下降了近50％，迁移能力受损，并与危险因子的数目成反向线性关系，而且高危者epc更易老化. 因而人们采用各种手段来增加epc的数量，促进冠心病患者血管新生和内皮修复. kawamoto等［9］发现体外扩增的epcs注入心肌缺血模型中，可促进缺血部位血管形成. 但低频脉冲电磁场对epcs作用的 研究 报道较少.

我们的结果提示,同一磁场强度下，不同磁场作用时间可影响epcs增殖活性，具有时间累积效应，短时间内与对照组相比并无统计学差异，随着作用时间的延长，表现出促进细胞增殖的效应. 从细胞周期代谢过程来看．细胞周期各时期的dna含量不同，g1期是dna合成前期，s期是dna合成期，增殖旺盛的细胞处于s期的比例较高. (s+g2m) (pr1)就代表了该群体中增殖期细胞的数量，可反映出细胞增殖的状态 . 我们采用流式细胞仪检测细胞周期，结果发现磁场照射4 h以后，处于增殖期的细胞数量开始增加，这与上述结果一致. 说明低频脉冲电磁场可促进epcs的增殖.

no作为迄今为止体内最简单的信息传递分子，已发现其具有舒张血管，抗凋亡等作用，stefania等［10］发现no可促进内皮细胞增殖、迁移及管腔形成. 我们发现低频脉冲电磁场作用8 h后no分泌增加. 总之，低频脉冲电磁场可增加体外培养的epcs的数量，促进no分泌，这种作用可能与其对no的生物合成、释放、运转等刺激有关，其具体机制还有待于进一步的研究.

【 参考 文献 】

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［3］ kalka c, masuda h, takahashi t， et al. transplantation of ex vivo expanded endothelial prog? enitor cells for therapeutic neovascularization［j］. proc natl a2cad sci usa, 2000, 97(7):3422-3427.

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［7］ hill jm, zalos g, halcox jp, et al. circulating endothelial progenitor cells, vascular function, and cardiovascular risk［j］. n engl j med，2003，348:593-600.

［8］ vasa m, fichtlscherer s, aicher a, et al. number and migratory activity of circulating endothelial progenitor cells inversely correlate with risk factors for coronary artery disease［j］. circ res，2001，89：1-7.

［9］ kawamoto a, gwon hc, iwaguro h, et al. therapeutic potential of ex vivo expanded endothelial progenitor cells for myocardial ischemia［j］. circulation，2001，103:634-637.

［10］ stefania b, cristiana p, andrea c， et al. a cellular system to study the r?ole of nitric oxide in cell death, survival, and migration［j］. neurotoxicology，2005，26 (5)：841-845.