冰酚软膏微生物限度检查方法学验证

摘要 目的：建立冰酚软膏微生物限度检查法.方法：以4株细菌、2株真菌对冰酚软膏进行了微生物限度检查方法的验证试验。结果：试验组金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌采用薄膜过滤法（冲洗量300mL）回收率为85%以上；白色念珠菌、黑曲霉菌采用平皿法回收率为87%以上；控制菌检查中采用直接接种法，可检出铜绿假单胞菌；采用薄膜过滤法（冲洗量300mL），可检出金黄色葡萄球菌。结论：经验证冰酚软膏采用薄膜过滤法检查细菌，常规法检查霉菌、酵母菌，直接接种检查铜绿假单胞菌，波膜过滤法检查金黄色葡萄球菌。

关键词：冰酚软膏；微生物限度检查；方法学验证

冰酚软膏是我院自行配制的医院制剂，其主要成分为冰片、丹皮酚等，具有消炎止痒之作用，多年来一直备受广大患者的推崇，经多年临床验证表明，疗效显著，且不良反应小。为更好地控制药品质量，我们参考相关文献[1-4]对其微生物检查方法进行验证。

1 仪器与材料

1.1 仪器设备：净化工作台；PL2001-L电子天平（梅特勒-托利多公司）；HTY-761匀浆仪、HTY-ⅢA集菌仪、开放式薄膜过滤器（杭州高德泰林有限公司）；BIO-Ⅱ-A2生物安全柜（上海振梓空气净化设备有限公司）；YQL-LS-50SⅡ立式压力蒸汽灭菌器（上海博讯实业有限公司）；GHP-9162电热恒温培养箱（扬州慧科电子有限公司）；MJX-160B-Z霉菌培养箱（上海博讯实业有限公司医疗设备厂） 。

1.2 试药与培养基

营养肉汤培养基、改良马丁液体培养基、改良马丁琼脂培养基、营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、胆盐乳糖培养基（BL） 、亚碲酸钠肉汤培养基等均由中药品生物制品检定所提供。稀释剂：pH7.0蛋白胨-氯化钠缓冲液（稀释供试品用，中国药品生物制品检定所提供），聚山梨酯80（分析纯）

1.3 供试品：冰酚软膏（规格：每盒重10g，生产厂家：上海海虹（实业）集团巢湖今辰药业有限公司，批号：20130511，20130512，20130513）

1.4 试验菌：

大肠埃希菌（Escherichia coli）〔CMCC（B）44102〕，金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）〔CMCC（B）26003〕，枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）〔CMCC（B）63501〕，铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）〔CMCC（B）10104〕，白色念珠菌（Candida albicans）〔CMCC（F） 98001〕，均由中国医学菌种保藏中心提供；黑曲霉（Aspergillus niger）〔CMCC（F）98003〕，由中国药品生物制品检定所提供。

2 方法和结果

按中国药典2010年版一部附录ⅩⅢ C有关微生物检查方法验证试验[2][3]。

2.1 菌液的制备 ①取经35℃培养18～24h的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌的新鲜营养肉汤培养物1mL，用0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释至10-5～l0-9，使成50～100cfu・mL-1，经活菌计数后备用。②取经25℃培养24～48 h的白色念珠菌液体培养物1mL，用0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释至10-5，使成50～100cfu・mL-1，经活菌计数后备用。③取经25℃培养1周的黑曲霉斜面培养物，用0.9%无菌氯化钠溶液5mL洗下黑曲霉孢子，吸取出孢子悬液1mL，加0.9%无菌氯化钠溶液适量稀释，用标准比浊管比浊，其浊度与标准比浊管浊度相当后，取此孢子悬液1 mL，用0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释至10-5，使成50～100cfu・mL-1，经活菌计数后备用。

2.2 供试液制备 取10g供试品，加45℃的含0.1%聚山梨酯80的pH7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液稀释至100mL，用匀浆仪搅匀，制成1：10的均匀供试液.

2.3 平皿法

2.3.1 试验组 取1：10倍供试液1mL和1mL已制备好的菌液，注入同一平皿，迅速倒入15～20mL45℃左右的相应琼脂培养基，待凝，每个菌株制备2个平皿。细菌在30～35℃培养箱中培养48h；霉菌在23～28℃培养箱中培养72 h，点计菌落数，取均值。

2.3.2 菌液组 分别取菌液1mL注入平皿内，每种菌平行制备2个平皿，测定所加的试验菌数。

2.3.3 供试品对照组 按试验组方法，不加菌液，测定供试品菌数（本底菌）。

2.3.4 回收率测定 按下列公式：

试验组的菌回收率%= 试验组平均菌落数-供试品对照组平均菌落数菌液组的平均菌落数 ×100%（以下同）计算回收率，平皿法的回收率结果见表1。

从表1结果看，采用检查供试品，人工污染5种菌株，金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌回收率低于70%，在3次独立的试验中，大肠埃希菌、白色念珠菌和黑曲霉的回收率均大于70%，因此可以采用平皿法对该药品的霉菌和酵母菌进行计数检查。

2.4 培养基稀释法

2.4.1 试验组 取1：10倍供试液0.5mL・皿-1、0.2mL・皿-1，分别与已制备好的1 mL细菌菌液注入同一平皿，迅速倒入15～20mL45℃左右的营养琼脂培养基，待凝，每个菌株制备2个平皿，倒置在30～35℃培养箱中培养48h，点计菌落数，取均值。

2.4.2 菌液组 同2.3.2。

2.4.3 供试品对照组 按试验组方法，不加菌液，测定供试品菌数（本底菌）。

2.4.4 回收率测定 方法同2.3.4，结果见表2。

由表2可知，通过培养基稀释法，金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌回收率还是不能满足要求。

2.5 薄膜过滤法

2.5.1 试验组 取1：10的供试液1mL，加入到50 mL pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液中，再经开放式薄膜过滤器滤过，分别用pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液300mL，每次100mL进行冲洗。在最后1次冲洗液中分别加入已制备好的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌与枯草芽孢杆菌1mL，过滤，取出薄膜贴于琼脂培养基上，平行制备两膜。

2.5.2 菌液组 同2.3.2。

2.5.3 供试品对照组 按试验组方法，不加菌液，测定供试品菌数（本底菌）。

2.5.4 回收率测定 方法同2.3.4，结果见表3。

从表3结果看，采用薄膜过滤法（冲洗量300mL）检查供试品，人工污染3种

细菌菌株，3次平行试验，金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的回收率均大于70%，可用于供试品细菌检查。