复方四季青软膏的制备及质量控制

[摘要]目的 鉴别复方四季青软膏中各主药的真伪；研究复方四季青软膏的制备方法；建立复方四季青软膏含量的控制方法。 方法 以薄层色谱法鉴别四季青叶、大黄、紫草；以紫外分光光度法测定紫草中左旋紫草素的含量。 结果 左旋紫草素的乙醇溶液在5.64～33.87μg/mL范围内，A与C呈良好线性关系，r=0.9999（n=6），平均回收率为98.80%，RSD（%）=0.88（n=6）。 结论 该方法准确、简便，重现线好，可用于复方四季青软膏中紫草含量的控制。

[关键词] 复方四季青软膏；含量测定；左旋紫草素

[中图分类号] R927 [文献标识码] B [文章编号] 2095-0616（2014）18-29-05

复方四季青软膏（原药名紫柄冬青药膏）为我院20世纪70年代烧伤科长期使用的外用制剂，临床用于治疗烧、烫伤、止痛、生肌活血等 ，该制剂疗效确切，用药安全，长期使用，未发现毒副作用，药材资源丰富，价格低廉。是我院沿用了多年的有效经验方[1]。紫草是复方四季青软膏中的君药 ，紫草性味甘、咸寒，具有凉血活血，解毒透疹的功效。是其最主要的药理作用[2]。主要成分为萘醌类色素和多糖类化合物。紫草具有凉血、活血、解毒透疹的功效、热毒盛、斑疹紫黑、麻疹不透、疮疡、湿疹、水火烫伤。现代药理学研究表明，紫草具有较好的抗菌、抗肿瘤、抗病毒、抗炎、抗过敏、保肝降酶等作用，是一种药用价值很高的植物[3]。

四季青为冬青科植物冬青（Ilie purpurea Hasr）的干燥叶，始载于唐《本草拾遗》（紫柄冬青即为四季青，为贵州习惯用名）。性凉，味苦、微涩。具有清热解毒、凉血止血、收敛生肌等功效。临床上主要用于肺炎、急性咽喉炎症、痢疾、胆道感染、外治烧伤、

下肢溃疡、皮炎、湿疹、手脚皲裂等。其主要成分有：酚酸类、三萜及三萜皂苷类、黄酮类、挥发油类以及鞣质等[4]。

大黄为蓼科多年生草本植物掌叶大黄、唐古特大黄或药用大黄的干燥根及根茎。本品味苦、性寒，具有攻积滞、导湿热、泻火、凉血、祛瘀、解毒等功效[5]。大黄功效独特，现代药理学研究表明其具有导泻、利胆、保肝、抗菌、抗病毒、抗炎、止血、降脂、抗肿瘤等多种生物活性。其中，泻下作用是其最主要的药理作用。已有研究表明：生大黄泻下作用峻烈，经酒制后其苦寒泻下作用稍缓；经酒蒸后，泻下作用缓和，并能增强活血祛瘀之功。大黄炭泻下作用极微，并具有凉血化瘀止血作用[6]。

复方四季青软膏中诸药配伍，协同增效，疗效显著，具有清热解毒、消肿止痛、收敛生肌的功效。为控制其制剂质量，我们选择紫草作为该制剂含量测定指标，参考中华人民共和国2010年版药典及相关文献，采用薄层色谱法鉴别了四季青、大黄、紫草等药材[7]，并用紫外分光光度法 建立了复方四季青软膏的质量控制方法[8-11]。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器 UV-2501型-紫外分光光度计（日本岛津企业管理有限公司）、METTLER-AE240型电子天平（上海梅特勒-托利多仪器有限公司）、LX-02型100克多功能粉碎机（上海江信科技有限公司）、HS102600D型超声波清洗机（天津奥泰仪器有限公司）、HH-4型数显恒温水浴锅（常州澳华仪器有限公司）、硅胶GF254薄层板（青岛海洋化工有限公司）、硅胶G薄层板（自制）、以羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶H薄层版（青岛海洋化工）。

1.1.2 药材 四季青（Ilicis Chinensis Folium，自采）、大黄（Radix et Rhizoma Rhei，贵州同济堂制药有限公司）、大黄（对照药材，中国药品生物制品检定所，鉴别用）、紫草（Radix Arnebiae，贵州同济堂制药有限公司）、紫草（对照药材，中国药品生物制品检定所，鉴别用）、金银花（Flos Lonicerae Japonicae， 贵州同济堂制药有限公司）、延胡索（Rhizoma Corydacis， 贵州同济堂制药有限公司）、冰片（贵州同济堂制药有限公司）。

1.1.3 试剂 左旋紫草素对照品（0769-9903，中国药品生物制品检定所，含量测定用）、四季青对照品（长梗冬青苷，111868-201001中国药品生物制品检定所）、大黄对照品（大黄素，110756-200110大黄酚，110796-201017中国药品生物制品检定所）、黄凡士林（南昌白云药业有限公司）、复方四季青软膏由贵阳医学院附属医院药剂科制剂室提供；硅藻土（化学纯，成都市科龙化工试剂厂）；其余试剂均为分析纯；所用水均为纯化水。

1.2 方法

1.2.1 处方 四季青叶100g，大黄80g， 紫草60g，金银花40g，延胡索20g，冰片4g，黄凡士林1000g。

1.2.2 制法 先称取200g黄凡士林加热熔化，加紫草60g以文火煎1h，用4层纱布滤过，滤液与残渣均留备用。再将800g的黄凡士林加热熔化，加处方量的大黄、延胡索以文火煎至焦黄后加处方量的金银花、四季青叶及上述紫草残渣以文火煎1h，用4层纱布滤过，合并两次滤液，稍冷后加入冰片4g，搅拌使其完全溶解，放冷，分装，即得。

1.2.3 药材鉴别 （1）四季青叶的定性鉴别。取本品粉末3g，加乙酸乙酯60mL，超声处理30min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇3mL溶解，作为供试品溶液。另取长梗东青苷对照品，加甲醇制成每1mL含1mg的甲醇溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法试验，用毛细管分别吸取上述两种溶液适量，分别点与同一硅胶GF254薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-甲酸（7∶1∶0.2）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外灯（254nm）下检视，供试品色谱中，在于对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；喷以1%的香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。（2）大黄的定性鉴别。取本品粉末0.1g，加甲醇20mL，浸泡1h，滤过，取滤液5mL，蒸干，残渣加水10mL溶解，再加盐酸1mL加热回流30min，立即冷却，用乙醚分两次振摇提取，每次20mL，合并乙醚液，蒸干，残渣加三氯甲烷1mL使溶解，作为供试品溶液。另取大黄对照药材0.1g，同法制成对照药材溶液。再取大黄素对照品，加甲醇制成每1mL含1mg的甲醇溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法试验，用毛细管吸取上述三种溶液适量，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶H薄层版上，以石油醚（30～60℃）-甲酸甲酯-甲酸（15∶5∶1）的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外灯（365nm）下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的橙黄色荧光斑点，置氨蒸气中熏后，斑点变为红色。（3）紫草的定性鉴别。取本品粉末0.5g，加石油醚（60～90℃）20mL，超声处理20min，滤过，滤液浓缩至1mL，作为供试品溶液。另取紫草对照药材0.5g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法试验，用毛细管吸取两种溶液适量，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-甲苯-乙酸乙酯-甲酸（5∶5∶0.5∶0.1）为展开剂，展开，取出，晾干。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的紫红色斑点；再喷以10%的氢氧化钾甲醇溶液，斑点均变为蓝色。

2 含量测定

2.1 对照品溶液的制备

精密称取（1/10万天平）左旋紫草素对照品5.04mg，置50mL容量瓶中，加乙醇溶解并稀释至刻度摇匀，作为对照品溶液。

2.2 供试品溶液的制备

称取本品5g，置小烧杯中，加硅藻土5g，搅匀后移至具塞锥形瓶中，加100mL乙醇，于50℃水浴中 ，超声40min，放冷，静置，滤过，精密取续滤液5mL至25mL量瓶中，加乙醇至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

2.3 左旋紫草素对照品最大吸收波长的测定

取左旋紫草素对照品乙醇液，以乙醇为空白对照，在600～400nm波长范围内扫描，左旋紫草素对照品在516nm处有最大吸收。见图1。

2.4 样品紫外吸收图测定

取样品5g， 按“供试品溶液的制备”项下操作，在UV-2501紫外分光光度计上于600～400nm波长处扫描，516nm处有最大吸收。见图2。

2.5 缺紫草阴性样品对照液干扰试验

取缺紫草阴性样品5g，按“供试品溶液的制备”项下同法操作在UV-2501紫外分光光度计上于800～400nm波长处扫描，缺紫草阴性对照液在516nm处基本无吸收，且吸收度值极低，可忽略不计。

2.6 线性关系的考察

精密吸取对照品溶液1.4、2.8、4.2、5.6、7.0、8.4mL置25mL量瓶中，加乙醇至刻度，摇匀，以等量的乙醇液为空白对照，于516nm波长处测定吸收度。测定结果见表1。以浓度为横坐标，吸收度为纵坐标绘制标准曲线。经线性回归，得回归方程：y=23.157x+0.0017，r=0.9999，左旋紫草素在5.64～33.87μg/mL范围内A与C呈良好线性关系。见图4 。

图4 左旋紫草素对照品标准曲线

2.7 样品含量测定

称取各样品5g，按“供试品溶液的制备”项下同法操作，测定各样品中左旋紫草素含量。

2.8 加样回收率试验

称取四季青软膏2.5g、左旋紫草素对照品4.03mg置小烧杯中，加硅藻土2.5g，搅匀后移至具塞锥形瓶中，加100mL乙醇，于50℃水浴中加热 ，超声40min，放冷，静置，滤过，取续滤液5mL加乙醇定容至25mL量瓶中，测定吸收度，同法操作6次，计算其回收率。

3 结果

3.1 样品含量测定

3批样品的紫草素含量分别为0.0169mg/mL（20121105），0.0167mg/mL（20121106），0.0162mg/mL（20121112）。见表1。

3.2 加样回收率试验

平均回收率为98.8092%，RSD（%）=0.8849。见表2。

3.3 精密度试验

取同一对照品溶液同法测定6次，结果RSD（%）=0.13%（n=6），表明仪器精密度良好。

3.4 重复性试验

称取同批（20121112）复方四季青油膏样品6份各5g，分别按“供试品溶液的制备”项下同法操作，测定各样品吸光度，计算其左旋紫草素含量，测定结果RSD（%）=2.2%（n=6），说明重复性良好。

3.5 稳定性试验

取同一供试品溶液，分别在0.5、1、1.5、2、2.5、3 h，UV-2501型-紫外分光光度计上测定其吸光度，测得值RSD（%）=1.4%（n=6），表明供试品溶液在3h内基本稳定。

4 讨论

4.1 复方四季青软膏的提取方法

采用油煎法，在提取方法的研究中发现，若采用传统的一次提取法[12]，紫草的含量很低，而采用新的提取方法两次提取法（第一次单独用黄凡士林提取紫草，第二次将第一次留下的紫草残渣与其余药材再用黄凡士林提取一次），既不造成药材浪费，而且紫草含量大大提升，可高出一次提取法的两倍[13]。在复方四季青青软膏提取中还发现，不同产地与不同批次的紫草，含量差异较大， 无论是药材的剪碎还是在油煎的过程中，都对结果有着一定的影响。在整个试验中均需要用同一产地同一批次的紫草，以提高结果准确度。

表1 样品含量测定结果

批号 吸光度值 吸光度平均值 样品百分含量（%）

20121105 0.393 0.401 0.388 0.394 0.16

20121106 0.387 0.384 0.393 0.388 0.16

20121112 0.381 0.372 0.381 0.378 0.16

表2 加样回收率试验结果

样品号 样品含量 加入量 测得量 回收率（%） 平均回收率（%） RSD（%）

1 4.5149 4.03 8.4700 98.2675

2 4.5150 4.03 8.4780 98.2676

3 4.5100 4.03 8.4700 98.2600 98.8092 0.8849

4 4.5120 4.03 8.4900 98.7651

5 4.5100 4.03 8.4950 98.7690

6 4.5130 4.03 8.5670 100.5025

4.2 供试品的处理方法

采用醇提法。因紫草主含萘醌色素类物质，难溶于水，易溶于乙醇、石油醚、氯仿、乙酸乙酯等有机溶剂。考虑到生产成本与实际生产情况，选择乙醇作为溶剂对复方四季青软膏进行处理。对于乙醇浓度及乙醇用量的选择，因2010年版《中国药典》一部中已明确指出用95%的乙醇提取进行药材含量测定，说明其羟基萘醌总色素在95%的乙醇中溶解最好，故本实验选用的是95%的乙醇对供试品进行处理。而乙醇的用量，经过试验发现，100mL乙醇可以充分溶解5g样品。本实验采用的是100mL 95%的乙醇来处理供试品。样品测定结果表明， 通过对样品颜色的观察发现，左旋紫草素含量高的成品颜色深红， 而所测含量较低的成品颜色浅紫， 这可能与紫草原药材的质量有关。

4.3 测定方法的选择

据有关文献报道紫草含量测定可采用高效液相色谱法、薄层扫描测定法及紫外-可见分光光度法。本试验采用的是紫外分光光度法来测定紫草的含量，结果试验的重现性及回收率均较好。

5 结论

经供试品提取方法试验考查， 用100mL 95%乙醇，超声提取40min， 供试液稳定， 试验的重现性及回收率均较好，且该方法简便，准确，可用于复方四季青软膏中紫草含量的控制。

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（收稿日期：2014-06-26）