补中益气汤对肺腺癌顺铂耐药细胞株移植瘤裸鼠脾、胃和肺中PI3K和AKT表达的影响

[收稿日期] 2013-11-04

[基金项目] 国家自然科学基金项目（81072743）；辽宁省教育厅项目（L2010355）

[通信作者] *刘春英，Tel：13604062018，E-mail：

[作者简介] 刘亚莉，副教授，E-mail：

[摘要] 目的：探讨补中益气汤对肺腺癌顺铂耐药细胞株移植瘤裸鼠脾、胃、肺中PI3K/AKT信号通路的影响。方法：60只裸鼠随机分为：空白对照组、荷瘤对照组、顺铂组、补中益气汤低、中、高剂量组。分别给予相应干预后，测量移植瘤体积，计算抑瘤率。应用免疫组化，Real-time PCR方法检测裸鼠脾、胃、肺组织中PI3K，AKT蛋白和基因的表达水平。结果：不同浓度的补中益气汤联合顺铂能抑制移植瘤的生长，其中以中、高剂量组的抑制作用最强；荷瘤裸鼠的脾、胃、肺中PI3K，AKT蛋白和基因的表达均升高，以荷瘤对照组升高最显著，随着应用顺铂和补中益气汤浓度的增加，PI3K，AKT的表达逐渐降低，在脾、胃组织中与荷瘤对照组比较有统计学差异（P

[关键词] 补中益气汤；肺腺癌；移植瘤；裸鼠；脾、胃、肺；PI3K；AKT

肺癌是常见的肺部恶性肿瘤，症见咳嗽、低热、胸痛、咳血、面颈部水肿、声嘶、气促等，其死亡率居癌症之首，严重威胁人类健康。手术治疗是肺癌的首选方法，但许多患者在就诊时已经失去根治性切除的最佳时机；放化疗则成为治疗的主要手段，但化疗药物的耐药性和毒副作用，又限制进一步的应用。中医药在肺癌的治疗中积累了大量的经验，特别在改善晚期患者化疗的毒副反应方面，越来越受到人们的重视。本课题组前期的体外研究表明补中益气汤含药血清可抑制肺腺癌细胞株A549和A549/DDP的生长[1] ，降低细胞中磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）及其下游分子蛋白激酶B（AKT）的表达，可协同或增加顺铂对A549/DDP细胞的抑制作用，降低对顺铂的耐药性；体内研究表明不同浓度的补中益气汤灌胃后，可抑制移植瘤体积的增加，并降低瘤体内PI3K和AKT蛋白和基因的表达。临床研究表明补中益气汤配合化疗治疗可改善患者食欲及消化道的恶心、腹胀、腹痛等症状[2]。本研究旨在探讨补中益气汤改善消化道症状是否与其改变脾、胃、肺中PI3K/AKT信号通路有关。

1 材料

1.1 动物及细胞株 BALB/C裸鼠60只，SPF级，5周龄，雌雄各半，体重（20±2） g，购自北京维通利华动物实验技术中心，动物许可证号SCXK（京）2012-0001；A549/DDP细胞株（批号）购自中国医学科学院肿瘤研究中心细胞库。

1.2 药物与试剂 补中益气汤药物组成有黄芪18 g，甘草9 g，人参6 g，当归3 g，橘皮6 g，升麻6 g，柴胡6 g，白术9 g，全部药材购于辽宁中医药大学附属医院药房，经辽宁中医药大学药理实验室鉴定后，按成人日推荐量的2，1，1/2倍设置高、中、低剂量组。常规煎煮、过滤、水浴蒸发至每毫升含生药3.939，1.970，0.985 g，冷却后保存。

顺铂购自齐鲁制药厂（批号2030132DB）；DMEM培养液，胎牛血清，0.25%胰蛋白酶（美国Hyclone公司）；PI3K，AKT抗体购于南京凯基生物技术有限公司；Triozol Reagent（美国Invitrogen Life technologies公司）；PI3K，AKT荧光定量PCR试剂盒购于宝生物工程（大连）有限公司；引物合成由北京华大基因公司提供。

2 方法

2.1 动物饲养 BALB/C裸鼠饲养于屏障级的实验动物中心，喂食高压灭菌饲料，纯净水，保持12 h光照。

2.2 细胞培养 将A549/DDP置于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，培养箱温度为37 ℃，5%CO2，观察细胞生长状态，2～3 d换液1次，4～6 d用0.25%胰酶消化后传代。收集生长良好的耐药细胞，以PBS洗涤，调整细胞浓度为5×106个/mL，制备成A549/DDP细胞悬液。

2.3 分组与处理 裸鼠适应性喂养1周后，按随机数字表法分为6组：空白对照组、荷瘤对照组、顺铂组、补中益气汤高、中、低剂量组，每组10只。除空白对照组外裸鼠给予腹股沟皮下接种A549/DDP细胞悬液0.2 mL/只，观察各组成瘤情况，待肉眼观察到移植瘤出现时，空白对照组、荷瘤对照组给予生理盐水0.5 mL灌胃；顺铂组给予等量生理盐水灌胃的同时，腹腔注射顺铂2 mg・kg-1；补中益气汤高、中、低剂量组分别给予高、中、低浓度的补中益气汤（98.5，49.3，24.6 g・kg-1）灌胃，同时腹腔注射顺铂2 mg・kg-1，每日1次，共14 d。测皮下移植瘤的最大长径（a）和横径（b），计算肿瘤体积（肿瘤体积=a×b2/2）。末次给药24 h后处死裸鼠，无菌剥离瘤体，计算体积抑瘤率及药物对抑瘤作用的提高率[抑瘤率=（对照组瘤体积-药物组瘤体积）/对照组瘤体积×100%；抑瘤作用提高率=（药物组抑瘤率-对照组抑瘤率）/对照组抑瘤率×100%]，取各组裸鼠的脾、胃、肺器官，一部分用4%甲醛固定后，4 ℃冰箱保存。另一部分置于-80 ℃冰箱保存。

2.4 裸鼠脾、胃、肺中PI3K，AKT蛋白表达的检测 将固定后的样本取出，经常规脱水，透明、浸蜡，包埋后，将每个样本蜡块连续切片3张，每张厚约4～5 μm。切片常规脱蜡至水，PBS清洗5 min×3次，高压热修复，内源性过氧化物酶阻断，PBS清洗5 min×3次，加一抗37 ℃孵育1 h，PBS清洗5 min×3次，加二抗37 ℃孵育45 min，PBS清洗5 min×3次，DAB显色，透明后封片。以PBS代替一抗作为阴性对照组。免疫组化结果采用Image Pro Plus医学图像分析系统进行图像分析，在400倍高倍镜下，随机取5个视野，每个视野为2 592×1 944像素点，分别测出阳性反应细胞的总面积（Area） 和积分吸光度（IA），求出平均吸光度。

2.5 实时定量PCR方法（Real-time PCR）检测裸鼠脾、胃、肺中PI3K，AKT mRNA的表达 在PCR反应体系中加入荧光染料，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后对未知模板进行相对定量分析。利用Primer Premier 5.0软件设计PCR引物，PCR 引物见表1。取各组样品，分别进行脾、胃、肺总RNA的提取，待样本纯度检测计算合格后，按逆转录试剂盒说明进行逆转录合成cDNA。各基因完成PCR扩增循环后，进行产品熔解曲线分析，以确定产品纯度。根据PCR产物熔解曲线的平均熔解温度确定产物的纯度。如果产物特异， 熔解曲线无杂峰， 平均熔解温度一致。

2.6 统计学处理 利用SPSS 16.0软件对数据进行统计学分析。计量资料采用±s表示，多组间比较如符合正态分布、方差齐时，采用单因素方差分析，两两比较采用SNK法。不符合参数检验时，采用多组计量资料秩和检验，P

3 结果

3.1 裸鼠一般状况 各组实验动物未见明显的拒食、不安、便溏现象。致瘤率以实验结束时解剖出瘤组织并经HE染色证明为标准。补中益气汤高剂量组有2只，补中益气汤中剂量组有1只未出现瘤组织，从样本含量上给予剔除。各组的抑瘤率及抑瘤作用的提高率见表2。

3.2 各组裸鼠脾、胃、肺中PI3K，AKT蛋白表达水平 PI3K主要是表达在细胞核外，阳性表达为黄棕色或黄褐色均匀颗粒。PI3K在肺组织荷瘤对照组

表达明显增多，呈黄褐色，而在顺铂组和补中益气汤低剂量组中细胞呈棕黄色，在空白对照组和补中益气汤中、高剂量组中呈淡棕色，见图1。AKT在脾组织表达及分布情况见图2。脾、胃、肺3种脏器中各组裸鼠肺组织中PI3K，AKT的表达水平见图3。与空白对照组比较、荷瘤对照组、顺铂组、补中益气汤低、中、高剂量组PI3K，AKT水平均升高，以荷瘤对照组升高最为显著（P

图1 免疫组化观察裸鼠肺脏PI3K表达及分布（IMC，×200）

Fig.1 The expression of PI3K in lung（IMC，×200）

3.3 各组裸鼠脾、胃、肺PI3K mRNA表达水平的变化 在脾、胃、肺3种脏器中，荷瘤对照组PI3K mRNA表达水平明显高于空白对照组（P

图2 免疫组化观察裸鼠脾脏中AKT表达及分布（×200）

Fig.2 The expression of AKT in spleen（IMC，×200）

组与荷瘤对照组相比，PI3K mRNA表达水平降低（P

3.4 各组裸鼠脾、胃、肺AKT mRNA表达水平的变化 在脾、胃、肺3种脏器中，荷瘤对照组AKT mRNA表达量水平高于空白对照组和其他各治疗组（P

4 讨论

中医本无“肺癌”一名，根据其症状，可将肺癌归于肺积、咳嗽、喘证、肺萎、痰饮等范畴。多由邪毒犯肺伤脾，使肺失宣降，脾失健运，痰浊内生，上归于肺，痰气交阻，日久痰瘀互结，耗气伤津，终至肺脾两虚。加之化疗药物进一步损伤脾胃，脾胃虚弱导致气血生化无源，更使正气亏虚，气血瘀滞，病症经久不愈。故中医药治疗晚期肺癌需采用扶正培本法，治宜补脾益肺，培土生金，方用补中益气汤。

顺铂是肺癌化疗的主要药物之一，在干扰肿瘤细胞的同时也会干扰正常细胞的生长，产生诸如消化道反应、肾毒性、神经毒性和骨髓抑制等副作用。

与空白对照组比较1）P

图3 各组裸鼠脾、胃、肺中PI3K，AKT蛋白表达水平比较

Fig.3 The expression of PI3K and AKT in spleen，stomach and lung

胡强等[3]应用补中益气汤对晚期肺癌患者化疗毒副反应的观察中发现恶心、呕吐以及白细胞及尿素氮、肌酐的异常率明显下降，体力状况Karnafsky评分改善率优于对照组。从中医角度分析应用补中益气汤是补虚扶正、培本固元、益气补血、健脾补肾，整体上达到扶正驱邪的效果。

吴宗群等[4]研究发现补中益气汤可通过提高脾虚小鼠脾脏及胸腺指数的影响、红细胞免疫功能以及NK和腹腔巨噬细胞分泌的TNF活性，T淋巴细胞活性而增强非特异性免疫功能并可通过增强NK细胞的活性而发挥抗癌效果。刘晓玲等[5]发现补中益气汤可对脾气虚大鼠胃黏膜EGFR蛋白的表达增多，提示补中益气汤可刺激胃黏膜的修复重建机制，可能还会通过活化其下游的或其他的信号转导通路进一步促进胃黏膜细胞的运动、分化、增殖可能有一定的保护作用。因此，补中益气汤改善肺癌患者化疗后的作用可能是通过多靶点、多种机制实现的，本研究旨在探讨移植瘤裸鼠在应用顺铂和补中益气汤治疗后脾、胃、肺中PI3K和AKT表达的影响。

本研究发现：给予顺铂和补中益气汤干预荷瘤裸鼠后，补中益气汤中、高剂量组的抑瘤率明显高于顺铂组和补中益气汤低剂量组（P

PI3K及其下游分子蛋白AKT参与细胞的增值、分化、凋亡和葡萄糖转运等多种细胞功能的调节，与人类肿瘤的发生、发展密切相关。在人类肿瘤如乳腺癌、肺癌中存在着PI3K，AKT的持续活化以及表达增多。PI3K激活后，产生的第二信使PIP3使AKT磷酸化而激活，磷酸化AKT通过激活或抑制其下游靶蛋白来调节细胞的增殖分化凋亡以及迁移等。根据本实验，荷瘤对照组中脾、胃、肺的PI3K，AKT的表达增加，由此推测其下游靶蛋白表达的也要相应的增多，该部位细胞发生凋亡抑制、分化障碍、增殖加快的机率将增加。因此补中益气汤的应用在降低PI3K，AKT的表达水平的同时，也会降低患病风险，补中益气汤对PI3K和AKT表达的影响及其下游信号通路的作用靶点也将成为今后研究的方向。

目前研究报道荷瘤裸鼠瘤组织内PI3K/AKT等转导通路上因子改变的文献较多，而鲜有荷瘤裸鼠其他脏器内信号转导通路变化的相关报道。本研究结果从侧面揭示了肺癌是一种全身性疾病，同时也为中医“金土相生”理论的实验研究提供了思路与方法。

[参考文献]

[1] 易佳丽，井欢，王莹，等. 补中益气汤含药血清对A549DDP中p-AKT和P-gp表达的影响[J]. 中国实验方剂学杂志，2013，19（17）：229.

[2] 蔡红兵，罗荣城，徐萌，等，补中益气汤配合化疗治疗而行肿瘤的临床观察[J]. 中药材，2003，26（2）：153.

[3] 胡强，汪宏云，杨勇刚. 补中益气汤改善晚期肺癌化疗毒副反应的临床观察[J]. 浙江中医药大学学报，2008，32（2）：220.

[4] 吴宗群，解建国. 补中益气汤提高机体免疫力的实验研究进展[J]. 中成药，2003，24（1）：62.

[5] 刘晓玲，王汝俊，张千桥. 补中益气汤对脾气虚大鼠胃粘膜EGFR蛋白表达的影响[J]. 中药药理与临床，2012，28（5）：12.

[6] 王汝俊. 补中益气汤“调理脾胃”药理作用研究[J]. 中药药理与临床， 1987， 3（2）： 4.

[7] 王汝俊. 补中益气汤的药理作用研究――抗实验性胃溃疡作用与机理[J]. 中药药理与临床，1991， 7（5）： 5.