不同方法从绞股蓝种子中提取基因组DNA的研究

摘 要：以绞股蓝种子为研究材料，采用改良的CTAB法、改良的SDS法和高盐低pH法对绞股蓝基因组DNA进行提取，对提取效果采用紫外分光光度计检测、琼脂糖凝胶电泳和RAPD进行综合比较分析。结果表明：3种提取方法所获得的DNA，其OD260/OD280多数都在1.80～2.00，琼脂糖凝胶电泳结果也显示DNA 的质量很好，改良的SDS法提取效率显著好于改良的CTAB法和高盐低pH法；而且改良的SDS法提取的DNA的RAPD图谱条带最亮、最清晰。因此，从DNA产量、质量等方面综合考虑，改良的SDS法为绞股蓝种子DNA提取的有效方法。

关键词：绞股蓝；基因组；CTAB法；SDS法；高盐低pH法

中图分类号 S567 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2013）18-22-03

绞股蓝（Gynostemmna pentaphullum（Thumb）Makino）为葫芦科多年生蔓生藤本植物，含有多种皂甙成份、黄酮类物质及多种氨基酸、维生素、微量元素等，系统的药理学和临床医学研究证明绞股蓝有抗疲劳、增强免疫力、消除激素类药物的副作用、降血脂、降血压、减肥、抗动脉粥状硬化、抗冠心病、健胃增食、改善睡眠、乌发养颜等多种保健功效[1-3]。

从绞股蓝提取高质量DNA是进行绞股蓝分子生物学研究的基础，而绞股蓝是多年生植物，富含酚类物质和多糖，一些常规DNA提取方法在提取多年生植物材料时，难于去除多酚杂质和多糖，常出现获得的DNA产量低，质量差，产品DNA易降解等问题，有时甚至不能用作相关的DNA研究；并且绞股蓝发芽率低，需经过长时间培养才能长出幼苗。因此，本文选用绞股蓝种子作为研究材料，针对其具体特点，在常规的提取方法SDS法[4-5]、CTAB法[6-8]、高盐低pH法的基础上进行适当的改进。通过对提取效果进行比较分析，旨在找到一种简便、快捷而又经济的高质量绞股蓝种子基因组DNA的提取方法，为绞股蓝DNA多态性分析及DNA分子辅助选择研究提供技术基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料 绞股蓝种子购置于安康平利县百草堂科技有限公司绞股蓝种质资源圃基地。

1.2 试剂和仪器 CTAB、SDS、EDTA、PVP，Taq酶、dNTP、引物及其他药品均购于上海生物工程公司。HZS-H水浴振荡器，UV-2100型紫外可见分光光度计，GL-20G-Ⅱ高速冷冻离心机，TGL-16G台式离心机，恒压、恒流DF-D电泳仪，UV-ⅥA型紫外透射反射仪。

1.3 提取方法 根据绞股蓝种子富含多酚多糖等特点，以常规SDS法、CTAB法和高盐低pH值法为基础，称取100mg绞股蓝种子于预冷研钵中，加入玻璃砂迅速研磨成细粉状后，立即转入1.5mL的灭菌离心，经优化各提取步骤，得到改良SDS法、改良的CTAB法和改良的高盐低pH法。

1.3.1 改良的SDS法 （1）裂解。向上述离心管中加入 500μL DNA 提取液（100mmol/L Tris-HCl（pH8.0），50mmol/L EDTA（pH8.0），1%（w/v）PVP-40，1.4mol/L NaCl，用前加β-巯基乙醇至终浓度为2.5%）500μL，混匀后加入80μL 10% SDS，65℃水浴15min（间隔晃动3次）。加入100μL 5mol/L KAc，混匀后冰浴30min。

（2）离心。将样品管于 12 000r/min 离心5 min，离心后将上清液小心转移到吸附柱中，室温放置2～3 min，12 000 r/min离心1min，离心后将上清液再次转移到同一吸附柱中，12 000r/min 离心 1min，弃废液。

（3）漂洗。向离心管中加入 500μL 70% 乙醇 ，振荡起沉淀数秒钟，12 000r/min 离心 1min，弃废液；重复1次。去上清液后再重复洗涤沉淀1次。风干后溶于适量TE缓冲液。得到的样品于冰箱-20℃保存备用。

1.3.2 改良的CTAB法 （1）裂解。向上述离心管中加入500 μL DNA 提取液（2% CTAB，1.4mol/L的NaCl，20 mmol/L的EDTA，100 mmol/L Tris・Cl，0.1%β-巯基乙醇，pH 8.0），65℃水浴15min（间隔晃动3次）。加入100μL 5mol/L KAc，混匀后冰浴30min。

（2）离心。离心管稍冷却后加入等体积的氯仿/异戊醇（24：1），静置分层后，在4℃，12 000r/min下离心10min，取上清液加入1/3体积无水乙醇轻微混匀后加入等体积氯仿/异戊醇（24：1）混匀，立即10 000r/min下离心10min，缓慢吸取上清液于1.5mL离心管中，上清液中加入浓度3mol/L的NaAc，2倍体积的无水乙醇，12 000r/min离心10 min，除去上清液。

（3）漂洗。用体积分数70%乙醇洗涤2次，自然晾干后溶于100μL TE，置于-20℃中保存。

1.3.3 高盐低pH值法 （1）裂解。向上述离心管中加入500μL DNA 提取液（100mM pH4.8 NaAc，50mM pH8.0 EDTANa2，500mM NaCl，2%PVP，1.4%SDS，其pH为5.5），65℃水浴2h。

（2）离心。室温10 000g离心10min，弃沉淀。加入2/3体积的pH4.8 2.5M KAc，混匀。0℃放置30min沉淀蛋白质，弃沉淀。上清液中加入0.6倍体积的-20℃预冷的异丙醇。温和混匀后于-30℃放置过夜使核酸充分沉淀，离心收集沉淀。750μL无菌蒸馏水溶解沉淀，并于50℃水浴助溶，离心弃不溶物。上清液中加入0.6倍体积异丙醇，1/10体积3M NaAc（pH5.2），混匀后于10 000g离心10min收集DNA。

（3）漂洗。500μL 70%乙醇洗涤沉淀，空气干燥5min。溶于40μL 0.1×TE缓冲液中。分装后存于4℃或-20℃备用。

1.4 DNA的检测

1.4.1 DNA纯度、产量检测 将提取的DNA样品稀释后，在Tu-1800spc紫外可见分光光度计上测定各样品在波长260nm及280nm处的光吸收值。根据A260/A280比值判断DNA的纯度，并根据A260计算DNA产量。

1.4.2 琼脂糖凝胶电泳检测 取8μL DNA加2μL上样缓冲液，混匀后在0.7%的琼脂糖凝胶上电泳，恒压80V，30min后在紫外透射反射仪上观察并照相，检测DNA的完整度和分子量大小。

1.4.3 RAPD检测 参照常规的PCR反应中各成分的量，将绞股蓝RAPD优化的初始反应体系确定为：反应体积25μL，l×PCR buffer，0.4μmol/L随机引物S90（AGGGCCGTCT），2mmol/L dNTP，1U Taq酶，2mmol/L MgCl2，50ng模板，用双蒸水补齐体积至25μL[9]。

扩增程序为：94℃预变性5min，94℃变性1min，37℃退火1min，72℃延伸1.5min，循环40次，最后于72℃延伸7min。产物经1.5%琼脂糖电泳，紫外凝胶成像仪上观察拍照。

2 结果与分析

2.1 不同方法提取DNA样品的纯度和产量 3种方法提取得到的DNA A260/A280都大于1.9，A260/A230=2.0，表明有RNA污染，为获得高质量的DNA样品，在提取获得的DNA样品中加入RNase后，提取绞股蓝DNA的效果存在差异，改良的SDS及改良的CTAB法提取的DNA A260/A280=1.8左右，说明样品基本无RNA污染，高盐低pH法去除RNA的效果较差。从产量上看，改良的SDS法最高，其次是改良的CTAB法，高盐低pH法得到的最少。3种提取方法所得DNA样品的纯度和产量见表1。

2.2 琼脂糖凝胶电泳检测结果 由图1可知，改良的SDS法和改良的CTAB法提取的DNA主条带都较为清晰，无明显拖尾现象，说明经过干燥保存后DNA仍能保持较好的完整性。而高盐低pH法经过RNA处理后，仍有拖尾现象，由于DNA中的多糖具有粘连性，常与DNA结合成复合物，使得DNA分子无法离开点样孔或电泳速度较慢。点样孔较亮、DNA电泳速度慢，其样品所含的多糖较多，反之则较少。改良的SDS法提取DNA电泳主带较亮且点样孔基本无异物，说明该方法对绞股蓝种子中多糖和次生代谢产物的去除效果较好。3种方法从种子中提取的DNA分子均大于2 000bp，能满足分子实验的要求。

2.3 RAPD的结果分析 不同提取方法得到的DNA分别用同一种随机引物在同等条件下进行RAPD反应，从RAPD反应产物的电泳图谱看（图2），3种方法所得DNA均有反应产物。改良的SDS法提取的DNA RAPD反应产物条带多而清晰，改良的CTAB法电泳条带多但亮度稍弱，高盐沉淀法RAPD条带数量较少且亮度最弱。经过重复试验，改良的SDS法RAPD反应重复性好，可用于进一步的分子生物学研究，而高盐沉淀法重复性相对较差，改良的CTAB法重复性最差。说明后2种方法提取的DNA中含有较多的杂质影响了RAPD反应的稳定性。

3 讨论

以种子为材料提取DNA可以不受采样时间、地点的限制，也解除了提取DNA过程中需要液氮研磨的麻烦。绞股蓝是多年生植物，种子表面有一层胶质，需经过特殊处理长时间培养才能长出幼苗，且发芽率低，不能满足在短时间内提取DNA的需要，因此，在进行绞股蓝分子生物学方面的研究时，利用种子提取DNA无疑是一条快速、简便的途径。

绞股蓝种子中含有大量的多糖、蛋白质、酚类等次生物质，这些多酚类化合物和多糖对于DNA质量的影响是植物分子生物学研究中最常遇到而又必须解决的问题，由于多糖可以抑制多种酶的活性，因此被多糖污染的总DNA样品无法用于进一步的分子生物学研究 [10-12]。本研究采用了改良的SDS法、改良的CTAB法和改良的高盐低pH法从绞股蓝种子中进提取DNA。整体看来，改良的SDS法在提取液中加入了1.4mol/L NaCl、1% PVP-40和1%β-巯基乙醇，检测结果表明次生物质去除较完全，用氯仿∶异戊醇（24∶1）代替苯酚抽提，降低了苯酚残存对DNA质量的影响。改良的SDS法用于绞股蓝干种子DNA的提取效果较好。而本实验中改良的CTAB法与常规的CTAB法步骤基本一样，提取液中用β-巯基乙醇代替了PVP，3mol/L NaAc代替了0.3mol/L NaCl，但实验表明β-巯基乙醇去除酚类和蛋白的作用在提取绞股蓝种子基因组DNA中作用并不明显，其得到的DNA产量和质量均不高，β-巯基乙醇对绞股蓝多糖的去除效果不明显的原因还有待于进一步研究。从DNA的纯度效果和检测结果等综合比较，高盐低pH法不适合绞股蓝种子DNA的提取。这与杨松杰[13]所报道的不一致，可能是两者所使用的实验材料不同所致。

经电泳分析、紫外检测及RAPD分析，发现改良SDS法最适合绞股蓝种子DNA的提取。表现在提取的DNA含量多、纯度高、RNA、蛋白质、多糖及酚类物质污染极少，扩增出RAPD图谱带型丰富、清晰。本方法体系的建立，为绞股蓝下一步的分子生物学实验打下良好基础，可供各位科研工作者在实践中参考.

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[13]杨松杰.药用植物绞股蓝（Gynostemma Pentaohyllum）多倍体育种研究进展[J].陕西农业科学，2012（6）：134-136.

（责编：施婷婷）