高糖干预骨髓来源MAPC细胞周期的研究

摘要：骨髓来源MPAC是具有多向分化潜能的成体干细胞，高糖是干扰MAPC细胞分化趋势的重要因素。通过流式细胞技术分析高糖对MAPC细胞周期的影响。研究显示，高糖迟滞MAPC细胞的细胞周期在Cl/S期。进一步研究的结果提示，高糖可以通过TGF-β1调控ERKl/2信号通路，选择性上调P21蛋白表达，抑制MAPC的细胞周期进程，此时的MAPC细胞Oct4高表达，具有多项分化能力（处于非分化状态）。

关键词：高糖；MAPC细胞；细胞周期；TGF-βi；P21；ERKl/2

中图分类号：R587.1

文献标识码：A

文章编号：1007-7847（2015）03-0229-08

高血糖可以通过阻断内皮细胞周期的Gl期影响其增殖[1]高糖抑制骨髓内皮祖细胞增殖与其细胞周期在s及G2期被抑制密切相关[2]。细胞周期调控涉及多种周期蛋白参与[3]。细胞周期蛋白和周期蛋白依赖性激酶（CDK）结合形成二聚体复合物，通过磷酸化作用表达CDK活性，其表达水平可随细胞周期发生变化；相反，CDK抑制因子通过与CDK结合抑制其活性，例如属于CIP/KIP家族的P21CIP/WAF-l和P27KIP-l。P21和P27通过抑制周期调控蛋白E-CDK2复合物的形成及其功能表达阻抑细胞周期进程[4]。转化生长因子TGF-pi可参与调控细胞周期的Gl/S期[7] 。内皮细胞、骨髓间充质细胞等多种细胞均可产生rGF-βl[5，6]。高糖可以促进TGF-β1在血管内皮细胞中表达，并通过TGF-β1介导P21及P27抑制内皮细胞周期调节蛋白E-CDK2复合物形成及其功能表达，阻抑细胞周期进程[8]。转录因子Oct4在胚胎干细胞及其他多能干细胞中高表达与维持干细胞的多向分化功能，自我再生和分化能力密切相关[9-11]。在大鼠胚胎干细胞中，Oct4表达水平可随细胞周期进程发生动态变化，在G2期Oct4达到表达峰值[12，13]。具有多向分化潜能的成体干细胞MAPC在未分化状态时Oct4高表达，在分化状态时Oct4表达明显下调。在不同细胞因子的诱导下MAPC可趋向不同细胞系分化，例如TGF-pi，VEGF等[14-16]。通过高糖干预未分化状态的MAPC细胞，分析其细胞周期的变化，探讨高糖对未分化状态时MAPC细胞周期影响的机制，从细胞周期层面分析高糖对MAPC增殖和分化的影响；为MAPC细胞在糖尿病血管病变损伤修复中的应用提供理论支持。

1材料和方法

1.1材料

MAPC细胞（俄亥俄州立大学），DMEM培养基购自美国Gibco BRL公司，TGF-pl单克隆抗体购自美国R&D Systems公司，小牛血清购自美国Sigma公司，PD98059抑制剂，P-ERK、P27、P21，CDK2、P-CDK2以及p-actin均购自美国Cell Sig-nal公司，P21抗体购自美国Santa Cruz公司，用于QPCR的引物均由美国Invitrogen公司合成。

1.2方法

1.2.1 细胞培养

MAPC细胞来源3或4周大小雌性Fischer大鼠[14-16]。在具有良好分化潜能的MAPC中Oct4阳性高表达（作为其特异性的标志之一）。在配制好的非分化细胞培养基中含有5.5 mmol/L右旋葡萄，以及ITS、LA-BSA、PDGF-BB、EGF、LIF等细胞因子以促进细胞更新，同时维持MAPC细胞的未分化状态。MAPC细胞的高密度培养，将细胞种植在6孔细胞培养板和24孔细胞培养板中，同时加入分化细胞培养基，该培养基的重要成分与非分化细胞培养基相同，但去除了PDGF、EGF和LIF这3种细胞因子。每隔24 h，最多不超过48 h更换一次分化细胞培养基。为排除特异性细胞因子的定向诱导作用，分化培养基中未加入TGF-pl，因此培养基中的TGF-β1均来源于MAPC细胞自身。对MAPC细胞进行干预，分为高糖组（分化培养基中右旋葡萄糖的终浓度为25.5 mmol/L）；正常组（分化培养基中右旋葡萄糖的终浓度为5.5 mmol/L）；对照组（分化培养基中加入左旋葡萄糖，左旋葡萄糖+右旋葡萄糖的终浓度为25.5 mmol/L）。

1.2.2细胞周期分析

利用流式细胞仪检测MAPC细胞周期的变化。MAPC细胞依照每cm2 200个细胞的密度种植在细胞培养板上，无血清DMEM同步化处理24 h。分别收集24 h、36 h、48 h以及72 h培养时间点的细胞，将其悬浮在4 0C PBS溶液中（含有0.1010葡萄糖），然后迅速加入70%冰乙醇（-20 0C）混匀。混悬细胞液在1 500 g离心力作用下离心，然后用PBS洗涤。用含有50 μL碘化丙啶（PI）和10 μL RNaseMix （20 mg/mL）的PBS重悬浮，使DNA固定，在37 0C中孵育30 min。通过FACS Calibur流式细胞仪分析细胞周期，结果通过Mod-Fit软件系统分析得到细胞周期图样结果。

1.2.3 实时定量PCR分析

利用RNeasy试剂盒（美国QiaGen Sciences公司）从各干预组MAPC细胞中提取总RNA，使用SmartSpec Plus核酸蛋白测定仪测定RNA浓度，TaqMan逆转录试剂盒（美国Applied Biosys-tems公司）将mRNA反转录为cDNA，通过Roche美国公司提供的软件设计Q Real-time PCR引物，并在美国Invitrogen公司合成设计好的引物。Mx3000P荧光定量PCR仪自动分析并输出Ct值作为结果。通过公式：基因的相对表达量=2-Ct（Ct=Ct目的基因-Ct内参基因；Ct=Ct各样本或各时间点样本一Ct正常样本或0时段样本）计算目的基因的相对表达量。各引物序列如下：P21上游5’-gacatctcagggccgaaa-3'，下游5'-ggcgcttggagtgatagaaa-3'，P27上游5'-tttga-cttgcat-gaagagaagc -3'，下游5'- agctgtctctgaaagggac-att-3'，Oct4上游5'-ctgtaaccggcgccagaa-3'，下游5' -tg-catggggagagcccaga -3'，GA PDH上、上游：5'-tgggaag -ctggtcatcaac-3’，下游5'-gcatcaccccatttgatgtt-3’。

1.2.4 Western-blot测定

从各干预组MAPC细胞中提取总蛋白，利用BCA法测定蛋白浓度，并依据测定的浓度在配制的PAGE胶中上样电泳，电泳后转膜、封闭，然后依据实验目的，各PVDF膜分别孵育在5010脱脂牛奶中，其中加入相应的一抗处理，在经过相应二抗处理后用ECL工作液显色并利用高敏胶片（美国GE公司）在暗室中曝光成像。通过核酸蛋白分析仪扫描分析后，用美国NIH提供的ImageJ软件分析条带灰度和面积后，通过内参照p-Actin校正，结果将用于蛋白表达量的半定量分析。

1.2.5 ELISA分析

待测样品（无论细胞培养上清或是细胞浆）需要加入盐酸激活，再加入氢氧化钠中和激活的样品，然后用TGF-pi ELISA试剂盒（美国R&DSystems公司）处理待测样品，利用Victor 3V 1 420多标记微孔板检测仪，在优化的450 nm波长处读取吸待测样品的光度值，并依据标准曲线所得公式计算各样浓度。

1.2.6免疫荧光分析

将实验用MAPC细胞依据实验目的种植在chamber板中，在相应的时间点去除细胞培养基并用多聚甲醛溶液固定细胞，加入相对应的一抗处理MAPC细胞，然后加入一抗相对应的荧光标记物标记的二抗，处理好的细胞样本置于NikonEclipse TE 2000-S荧光显微镜下观察，并用Nikon公司提供的软件分析处理得到的图像。

1.2.7统计学处理

所有实验数据均以s（标准误）表示，数据分析采用SigmaStat 2.03统计分析软件（美国Aspiresoftware international公司），统计分析法为t-test或是单因素方差分析；所有的结果均来自3组以上独立实验。P

2 结果

2.1 高糖选择性阻断MAPC细胞周期在G1/S期

通过流式细胞仪检测PI标记的MAPC，在非分化培基中培养36 h后，27.80/0处于Gl期，59.90/0处于S期，12.3 010处于G2期。在加入HG的培基中，细胞周期进程发生明显改变，68.3 010处于Gl期，19.2%处于S期，12.5 010处于G2期（图1A）。单纯高渗培养，MAPC的细胞周期进程未发现明显变化。在分化培基中高密度培养48 h，MAPC的细胞周期进程未受高糖刺激影响（图1B），与低糖及高渗培养基中无差异。显然，高糖刺激主要迟滞处于未分化状态的MAPC的细胞周期进程（图1）。

2.2 高糖对MAPC细胞P21和P27表达的影响

CDK-I（细胞周期依赖性蛋白激酶抑制因子）例如P21和P27，通过抑制细胞周期蛋白E-CDK2复合体的形成及其功能调控细胞周期进程。通过Western-blot及Q-PCR检测高糖培基中MAPC细胞P21、P27、CDK2及P―CDK2（磷酸化CDK2）表达水平。P21 mRNA表达水平是基础水平的3倍多（n=3，P

2.3 高糖作用下MAPC细胞TGF-β1、TGF-βR2、ERKl/2磷酸化水平和P21与细胞周期的关系

在高糖培养基中培养24 h，MAPC细胞TGF-βl mRNA表达水平上调，在36 h时到达表达峰值，为Oh时的20倍以上（图3 A）。在高糖培养基中培养24 h，MAPC细胞TGF-β1蛋白表达明显上调，在48 h持续上调（图3 B）。高渗培养对MAPC细胞TGF-β1 mRNA及蛋白表达无明显影响。进一步探讨TGF-[3R2特异性受体表达水平，结果显示，在36 h时间点，高糖上调TGF-pR2蛋白表达水平4倍以上（n=3；P

2.4 高糖对MAPC细胞AKT的影响

AKT作为一种重要的细胞因子参与细胞周期调控，因此在该实验中通过Western blot分析了MAPC细胞AKT的激活水平。结果显示，高糖对MAPC细胞AKT （Ser473）磷酸化水平的影响与低糖及高渗条件下无明显统计学差异，提示高糖无法通过AKT来调控MAPC细胞周期（图4）。

2.5 高糖对Oct4表达的影响

既往研究已证明MAPC细胞在高糖培基中培养7d，细胞的增殖及形态发生改变。在高糖和普通培养基中的MAPC细胞Oct4表达水平在mRNA及蛋白水平无明显变化（图SA、B）。TGF-pi抗体或PD98059抑制剂对MAPC细胞Oct4表达水平无明显影响（图SB）。在分化诱导培基中培养6d后，特异性vWF表达同时，Oct4表达明显下调（图5C），与众多的研究结果相同，提示MAPC开始分化。综合前期实验结果推测，高糖对MAPC细胞周期的影响，主要在分化前期，在MAPC保持多向分化潜能状态时（图5）。3讨论

细胞周期包括间期和有丝分裂期，间期又可分为Gl，S和G2期。Gl期是合成前期，此期主要合成RNA和核糖体，意义在于为下阶段S期的DNA复制作好物质和能量的准备；S期即DNA合成期，在此期，除了合成DNA外，同时还要合成组蛋白，DNA复制所需要的酶都在这一时期合成。G2期即DNA合成后期，在这一时期，DNA合成终止。间期是细胞合成DNA、RNA、蛋白质和各种酶的时期，是为细胞分裂准备物质基础的主要阶段。Gl期的细胞可分为增殖细胞，例如骨髓细胞；休止细胞，可能因外在因素导致该细胞暂时不过渡至S期；不增殖细胞，例如高度分化的神经细胞，这类细胞将停止在Gl期，最后通过分化、衰老至死亡。Gl/S期的过程是重要的细胞周期调控阶段，受到多种外在因素的干扰，导致细胞增殖能力发生改变。造血干细胞是明确的周期性细胞，保持连续进入细胞周期循环的能力，始终保持活跃的增殖能力。属于成体干细胞的MAPC处于分化前期时，需要增殖到一定程度，才能在不同细胞因子的诱导下趋向特定细胞系分化。因此，前期的增殖对后期的分化具有非常重要的意义。高糖阻滞Oct4高表达的MAPC在Gl/S期，可能影响MAPC细胞DNA合成过程，导致其诱导分化趋势发生改变。研究显示，P21和P27通过抑制E-CDK2复合体形成及其功能表达干扰细胞周期的Gl/S期[4]。高糖通过TGF-βl介导P21和P27迟滞血管细胞内皮细胞周期的5期[8]。高糖通过上调P21蛋白表达水平迟滞内皮祖细胞的细胞周期[18]。相反，高糖通过下调P21而非P27蛋白表达水平，使处于S期的间质细胞增加，处于Gl期的细胞减少[19]。TGF-β1通过调控P21蛋白表达水平迟滞人结肠癌细胞的细胞周期，而非P27蛋白。综上所述，高糖可选择性调控CDK-I（例如P21和P27）来干扰细胞周期。高糖迟滞MAPC细胞周期在Gl/S期，研究显示与选择性上调P21表达水平有关，而非P27表达水平，提示P21是阻滞MAPC细胞周期的关键因子。

TGF-pi涉及多种细胞的增殖、迁移、定植及分化过程，并且是再生血管形成过程的重要调控因子[20～22]。包括内皮细胞、间充质细胞在内的多种细胞均可通过产生的TGF-β1调控细胞周期[23]。高糖可作为刺激性因素上调多种细胞的TGF-pl表达水平[24，25]。近期研究显示，高糖可调控大鼠胚胎干细胞TGF-pl表达水平诱导其增殖[26]。TGF-β1通过与细胞膜表面特异性受体的结合发挥功能[27]。实验中利用TGF-β1特异性抗体中和TGF-β1，可有效抑制高糖调控TGF-βR2表达水平上调，高糖迟滞MPAC细胞周期的作用随之明显减弱。研究提示，高糖可调控TGF-βl相关细胞信号通路干扰MAPC细胞的细胞周期。

TGF-pi通过PI3 -KJAKT和MAPK-ERK磷酸化通路迟滞细胞周期在Gl期[28]。研究显示，高糖可以通过调控大晟胚胎干细胞的PI3 -K/AKT及MAPK信号通路影响细胞周期调控蛋白的表达水平[29]。同时，TGF-β1可参与ERKl/2细胞信号通路调控[30]。实验结果提示，高糖未能诱导MAPC细胞的AKT及磷酸化AKT表达水平发生明显改变，PI3 -K/AKT与MAPC细胞周期调控无关。同时，高糖诱导P21表达水平上调，伴随P-Smad表达上调及CDK2表达下调；提示TGF-pi通过TGF-pR2激活其下游的Smad和非Smad信号通路。实验组通过PD98059特异性抑制Erkl/2表达，下调的Samd2/3可以恢复，提示ERKl/2可以通过调控Smad通路影响CDK2表达水平。实验结果推测，高糖通过ERKl/2信号通路调控MAPC细胞的细胞周期。

特异性转录因子Oct4在胚胎干细胞及许多具有多向分化潜能的细胞中保持高表达水平，提示细胞保持自我再生能力及多向分化潜能，Oct4是公认的特异性标志[9，10]。在大鼠胚胎干细胞，Oct4表达水平随细胞周期呈动态变化，在G2期达到表达的峰值[13] 。抗肿瘤药物诺考达唑可在C2/M期阻断人胚胎干细胞的周期，伴有Oct4表达下调；去除药物影响后，细胞周期恢复正常，Oct4表达未随之恢复[31]。在MAPC细胞中，Oct4表达水平与细胞的再生能力、分化潜能相关。实验结果显示，在高糖刺激性下，当细胞周期进程受到到明显干扰时，Oct4表达水平无明显改变。说明高糖对MAPC细胞周期的影响是在其未分化阶段，MAPC保有多项分化潜能。

有研究显示，Gl期的长短直接影响祖细胞分化，例如神经前体细胞[32]。高糖干扰MAPC细胞STAT3和TGF-β1间的平衡，导致其分化趋势的改变网。高糖调控TGF-βl表达水平，通过ERKl/2细胞信号通路影响Smad或非Smad途径，上调P21表达，抑制CDK2表达，在Gl/S期迟滞Oct4高表达MAPC细胞的周期进程。实验结果显示，高糖可以通过调控处于未分化期MAPC细胞（Occ4高表达）的TCF-β1水平，在细胞周期层面改变MAPC细胞的分化趋势。