副猪嗜血杆菌PCR检测方法的建立与初步应用

摘要：针对副猪嗜血杆菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｓｕｉｓ，ＨＰＳ）１６ Ｓ ｒＲＮＡ序列设计１对特异性引物，能扩增出８２１ ｂｐ的特异性ＤＮＡ片段，并据此建立了快速准确鉴定副猪嗜血杆菌ＰＣＲ方法，临床试验证明该方法具有很好的特异性和敏感性。１３份疑似病料检测结果表明，ＰＣＲ检测结果与传统生化鉴定结果符合率为１００％。结果表明已成功建立了副猪嗜血杆菌ＰＣＲ检测方法，并可应用于临床副猪嗜血杆菌的检测。

关键词：副猪嗜血杆菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｓｕｉｓ，ＨＰＳ）；ＰＣＲ；检测

中图分类号：Ｓ８５２．６１ 文献标识码：Ａ 文章编号：0439－８114（２０12）17－3794-03

Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ａｎｄ Ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＰＣＲ Aｓｓａｙ ｔｏ Ｄｅｔｅｃｔ Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｓｕｉｓ

ＬＩＵ Ｊｉａｎ－ｋｕｉ，ＹＡＮＧ Ｘｉａｏ－ｙａｎ，ＷＥＩ Ｃｈｕｎ－ｈｕａ，ＬＩ Ｘｉａｏ－ｈｕａ，ＤＡＩ Ａｉ－ｌｉｎｇ，ＹＡＮＧ Ｌａｎ－ｘｉｕ

（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｌｏｎｇｙａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ／Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ｏｆ Ｌｏｎｇｙａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ／Fujian Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｚｏｏｎｏｓｉｓ／ Fujian Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｌｏｎｇｙａｎ ３６４０００， Ｆｕｊｉａｎ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ， ａ ｐａｉｒs ｏｆ ｐｒｉｍｅｒs ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｔｏ Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｓｕｉｓ（ＨＰＳ） １６ Ｓ ｒＲＮＡ ｇｅｎｅ ｗｅｒｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ａｎｄ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ａ ８２１ ｂｐ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｂｙ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）． Ｉｔ ｗａｓ ｃｏｎｆｏｒｍｅｄ ｔｏ ｂｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｓｕｉｓ ｉｎ ｐｉｇｓ ａｆｔｅｒ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ． Ｉｔ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ＰＣＲ ｍｅｔｈｏｄ ｗｅｒｅ １００％ ａｃｃｏｒｄａｎｃｅ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｃｌａｓｓｉｃ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ １３ ｓｕｓｐｅｃｔｅｄ ｓａｍｐｌｅｓ． Ｉｔ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ＰＣＲ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｆｏｒ Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｓｕｉｓ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｓｕｉｓ； ＰＣＲ； ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ

副猪嗜血杆菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｓｕｉｓ，ＨＰＳ）病又称格拉泽氏病（Ｇｌａｓｓｅｒ′ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）。ＨＰＳ是存在于猪的上呼吸道的一种常在菌，在特定条件下可以侵入机体，引起以呼吸道症状为主的全身性疾病，以纤维素性浆膜炎、关节炎和脑膜炎为特征［１－３］。该菌多与其他病原如猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒等混合感染，严重危害仔猪和青年猪的健康［４］。近几年来副猪嗜血杆菌病在猪场不断发生，已趋于流行，发病率和死亡率均呈显著上升趋势［１］。

由于副猪嗜血杆菌对营养要求比较苛刻，一般从病料中分离率较低［５］，使病原学诊断方法受到一定的限制。常规的血清学诊断方法存在操作繁杂、费时费力、敏感性和特异性低等不足［６］，和常规的诊断方法相比ＰＣＲ具有检测快速、特异性强、敏感性高的优点。因此，建立ＨＰＳ ＰＣＲ快速准确的诊断方法对ＨＰＳ的防治具有重要意义，并可为其流行病学调查提供技术手段。

１ 材料与方法

１．１ 菌株

副猪嗜血杆菌血清４型菌株由福建省预防兽医学与生物技术高校重点实验室分离并保存。链球菌、巴氏杆菌和产肠毒素大肠杆菌（ＥＴＥＣ）由本实验室保存。

１．２ 主要试剂

胰蛋白胨大豆琼脂（ＴＳＡ）培养基和胰蛋白胨大豆肉汤培养基（ＴＳＢ）购自北京陆桥技术有限责任公司；烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（ＮＡＤ）购自成都贝斯特试剂有限公司；ｒＴａｑ ＤＮＡ聚合酶和ＤＬ ２０００ Ｍａｒｋｅｒ为宝生物工程（大连）有限公司产品。

１．３ 引物设计与合成

按文献［７］的方法设计引物。上游引物为：５′－ＧＴＧＡＴＧＡＧＧＡＡＧＧＧＴＧＧＴＧＴ－３′，下游引物为：５′－ＧＧＣＴＴＣＧＴＣＡＣＣＣＴＣＴＧＴＡ－３′，目的片段为８２１ ｂｐ，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

１．４ ＨＰＳ的分离培养与生化鉴定

按文献［５］的方法进行。

１．５ ＰＣＲ模板处理

副猪嗜血杆菌血清４型菌株在ＴＳＡ培养基上培养，用接种环挑取可疑单一菌落溶于４０ μＬ无菌蒸馏水中，煮沸１０ ｍｉｎ，１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１ ｍｉｎ，上清液４℃保存备用。将疑似副猪嗜血杆菌病猪的肺脏、心包液、关节液等接种于ＴＳＢ液体培养基中，３７℃培养１８ ｈ后，取４０ μＬ菌液煮沸１０ ｍｉｎ，１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１ ｍｉｎ，上清液４ ℃保存备用。

１．６ ＰＣＲ扩增