咳喘宁对哮喘大鼠TLR4表达的影响

摘要：目的 观察咳喘宁对哮喘大鼠TLR4表达的影响，阐明其防治哮喘的作用机理。方法 用卵清蛋白复制大鼠哮喘模型，以布地奈德为阳性对照药，观察咳喘宁干预后肺泡灌洗液中、肺组织中TLR-4的改变情况。结果 TLR4在哮喘大鼠支气管粘膜上皮细胞、肺泡中有显著表达。咳喘宁能有效降低哮喘大鼠中TLR4的表达，从而减轻了气道的高反应性。布地奈德减少支气管粘膜、肺泡胞浆中TLR4的表达优于咳喘宁，差别无统计学意义。结论 咳喘宁能降低TLR4表达水平，提示咳喘宁治疗哮喘可能与下调TLR4表达水平有关。

关键词：哮喘；咳喘宁；TLR-4；麻黄；杏仁

支气管哮喘（bronchial asthnla。简称哮喘）是最常见的慢性肺部疾病。我国儿童哮喘总发病率为0.9%～1.1%，其中半数在3岁以前发病[1]，近年来发病率有明显上升趋势。该病是以特应质为基础。在各种诱发因索作用下产生的慢性气道变应性炎症。迄今为止，其发病机制仍未完全明确。大量研究显示，Toll样受体（Tolllike receptors，TLRs）是天然免疫和获得性免疫之间的桥梁，在哮喘的发生发展中可能起着较重要的作用[2]。咳喘宁对小儿哮喘有较好的疗效，为了探讨其作用机理，观察其对哮喘大鼠TLR4表达的影响。现将实验方法及结果报告如下：

1资料与方法

1.1一般资料

1.1.1动物 幼年SD大鼠（清洁级，120～180g，雄性，28～42d）分成四组：正常组、模型组、咳喘宁治疗组、布地奈德组。

1.1.2药物 咳喘宁由炙麻黄、杏仁、桃仁、大青叶、黄芪、生石膏、细茶和甘草等中药组成。湖南中医药大学第一临床医学院制剂室提供，批号：200501，每100mL含生药24.6g。

1.1.3试剂及仪器 鸡卵清蛋白，美国Sigma公司；氢氧化铝（分析纯），天津市科密欧化学试剂有限公司；TLR4抗体，武汉博士德；自制雾化箱；医用超生雾化器，上海四菱医用恒温设备有限公司；自动纯水双蒸馏器，上海玻璃仪器一厂；普通离心机（低速），湖南仪器仪表总厂离心机厂；4℃冰箱；微波炉；37℃温箱一台；石蜡包埋机、切片机；光学显微镜。

1.2方法

1.2.1动物分组及模型制 50只大鼠饲养于湖南中医药大学洁净动物实验室，每5只1笼，自由饮食，控制室温21 ℃左右，湿度55%左右。所有动物适应性饲养1周后开始实验。随机抽出16只作为A组即正常组，除A组外，其余34只大鼠分别于第1d和第8d分在胸部皮下三点及腹腔注射共1 mL含1 mg卵清蛋白（OVA）和100 mg氢氧化铝凝胶的无菌抗原液致敏，正常组于第1d和第8d分胸部皮下三点及腹腔注射生理盐水1ml；第9d～第21d为激发阶段，通过超声雾化器以5%卵清蛋白溶液雾化1次/d，30 min/次，连续2w。造模成功后34只大鼠随机分为四组：模型组（10只），布地奈德组（12只），咳喘宁组（12只）。

1.2.2治疗方案 造模后（激发阶段）进行治疗。雾化2次/d，20min/次。按照《药理学实验方法学》[3]人与动物等效剂量换算方法，各组药物用量如下：咳喘宁组以咳喘宁口服液雾化，每只量为0.66ml/次，溶于20 mL蒸馏水中雾化；布地奈德组以布地奈德每只0.05 ml/次，溶于20ml蒸馏水中雾化；正常组及模型组以等量蒸馏水雾化吸人。各组雾化治疗时间均为7 d。

1.2.3免疫组化染色 动物处死后切取肺组织，冰冻后行超薄切片（5u m）后用冷丙酮固定。后行TLR-4免疫组织化学染色。以细胞质染成棕黄色的细胞为TLR-4阳性细胞。

1.2.4图像分析、统计学处理 各种免疫组化阳性反应强度用图像分析系统进行定量分析。阳性反应强度应用图像分析系统灰度值（灰度值与阳性强度呈现反比） 表示。应用SPSS软件包AVONA方差分析差异显著性分析，所有数据用"均数±标准差"表示。

2结果

2.1肺组织病理形态改变 正常组气道粘膜完整无脱落，基膜无增厚，支气管管壁及周围炎性细胞浸润少见，模型组呈显著炎症变化，气道粘膜脱落，基膜增厚明显，肺泡内大量炎症细胞，支气管内有粘液栓形成，周围大量炎症细胞浸润。布地奈德组气道粘膜增厚不明显，粘膜下水肿少见，在肺泡壁支气管见少量炎性细胞浸润，咳喘宁组轻度炎症变化，较布地奈德组无明显差异。哮喘模型建立成功，咳喘宁治疗哮喘大鼠有效，且效果与布地奈德无明显差异。

2.2肺组织TLR4表达变化 免疫组化染色结果显示，TLR4阳性表达呈棕黄色或棕褐色，主要位于支气管粘膜及肺泡的细胞质中，细胞核及细胞膜中亦可见。TLR4在正常组偶见阳性表达；哮喘模型组表达增加，可见大量阳性反应细胞，主要分布在气管黏膜及肺泡中；咳喘宁组、布地奈德组阳性细胞表达较哮喘模型组明显减少，但仍较正常组显著，呈阳性表达。其中布地奈德组稍优于咳喘宁组。模型组TLR4阳性表达图像分析的灰度值（113.08±14.12）低于其他三组，组间比较均有显著差异（P

3讨论

研究表明，Toll样受体（toll likereceptor，TI R）介导天然免疫并连接获得性免疫，在气道炎症的调节中起重要作用，特别是TI R4介导的免疫反应参与了复杂的哮喘气道高反应形成过程。在哮喘气道炎症中，Th2细胞的优势应答是哮喘慢性气道炎症形成的基础。在过敏性气道炎症中，TLR4与适应性免疫调控联系紧密，其主要通过TLR4与适应性免疫调控联系紧密，其主要通过调节Thl/Th2型免疫应答参与了气道高反应形成[4]。既往研究认为，TLR4配体LPS水平决定气道炎症反应的类型：低剂量LPS能引起伴有肺嗜酸粒细胞、高血清IgE、IL-4、IL-5和IL-13水平的变应原特异性Th2应答；高剂量LPS则引起伴有中性粒细胞和IgG抗体产生的Thl应答。哮喘的严重程度与TLR4水平高低有关系，表明哮喘发作与TLR4有密切关系。

中医学认为.哮喘内有痰饮留伏，外因邪气引动而诱发。感受六淫外邪以风寒风热为多[5]。咳喘宁口服液以传统古方五虎汤为基本方研制而成。方中麻黄乃"喘家圣药"，味苦辛、性温，能宣肺气，平咳喘，其主要含麻黄碱，具有抗炎、平喘和抗过敏效应；苦杏仁味苦、性微温，能降肺气平喘止咳。二药有宣有降，可祛除外邪，畅通气道，从而降低气道反应性，共为本方君药。石膏味辛甘、性大寒，功在清泄肺热；大青叶清热抗炎，具有抗病毒作用；黄芪扶正祛邪，能增强机体免疫功能，增强病毒诱生干扰素的能力，抑制病毒，并具有类似激素样作用。三药合用，可清除哮喘的激发因素，共为本方臣药。桃仁活血化瘀以改善微循环，改善炎症病灶，尚可止咳平喘；细茶叶昧苦甘、性寒，功在清神化痰；甘草镇咳平喘，具有抗炎、抗变态反应作用，共为本方佐使。诸药合用，共奏发表清热、化痰平喘、清除哮喘激发因素、降低气道反应性等功效[6]。

既往研究表明：咳喘宁治疗病毒诱发的哮喘具有较好的疗效，能显著提高哮喘患儿血中Ⅱ-12、降低IL-4，其作用明显优于对照组（P

参考文献：

[1]中华医学会儿科分会呼吸学组，中华儿科杂志编辑委员会.儿童支气管哮喘诊断与防治指南[J].中华儿科杂志，2008，46：745.

[2]Chen I， Wang T， Zhang JY， et al. Toll-like receptor 4 relates to lipopolysaccharide-induced mucus hypersecretion in rat airway.Arch M ed Res，2009，40：10-17.

[3]徐叔云，卞如濂，陈修.药理实验方法学（第二版）[M].北京：人民卫生出版社，1991：178-179.

[4]Le Buanec H. Paturance S. Couillin I， et al. Control of allergic reactions in mice by an active anti murine II-4 immunization.Vaccine，2007，25：7206-7216.

[5]罗银河.中医药治疗小儿L支气管哮喘的研究进展[J].湖南中医学院学报，2005，25（6）：62.

[6]王盂清，罗银河，陈锡军.咳喘宁治疗病毒诱发的小儿哮喘的临床研究[J].额中医，2007，39（4）：1-17.

[7]王孟清，罗银河，陈锡军.咳喘宁治疗病毒诱发哮喘及对患儿Th亚群的调节作用[J].中医儿科杂志，2007，3（2）：28-30.

[8]董晓斐，罗银河，王孟清.咳喘宁对哮喘豚鼠EOS的调节作用[J].湖南中医药大学学报.2008，28（5）：36.编辑/申磊