带血管蒂骨膜瓣对异体骨移植血管化的影响

【摘要】 目的 研究带血供骨膜瓣对异体骨移植血管化的影响,修复骨缺损过程中对微血管生成的作用。方法 将兔的股骨经去抗原化后作为供体,制作带血供骨膜瓣包裹同种异体骨修复兔大段骨缺损的模型,实验设置对照组,即未用血管化骨膜瓣包裹移植物。分别在术后4、8、16周分别对移植物及周围软组织、骨组织进行组织学观察,观察内皮细胞生长因子(VEGF)的表达。对Ⅷ因子相关抗原特异性标记,比较不同时间微血管密度(MVD)的变化。结果 实验组骨组织哈佛氏管内较早出现微血管;在相同阶段,实验组VEGF的表达强于对照组,MVD高于对照组。结论 带血供骨膜瓣对异体骨移植的血管化过程有明显的促进作用。

【关键词】 骨膜瓣;异体骨移植;血管内皮生长因子;血管密度

Effect of vascularized bone flapon bone allograft vascular

ZHAO Jun,XU Hai-jin,LI Yun-jie,et al.

Huizhou Uninon Hopital Gudong,Huizhou 516000,China

【Abstract】 Objective To study the effect of vascularized bone flap on bone allograft vascular.To investigate the effect on microvessel of vascularized bone flap during bone allograft.Methods De-antigen rabbit femoral as the donor, a rabbit model of massive femoral defect was established and reconstructed with bone allograft covered with vascularized bone flap,and nonvascular bone flap as the control groups.Histological observation and immunohistochemical examination were done on bone and its surrounding tissues at 4,8,16 weeks postoperatively,and Ⅷ factor related antigen were marked to show the change of themicrovessel density (MVD). Results New micro vessel came into being in Harver’s channel in E group earlier, the expression of VEGF in E group were more stronger than in control group at the same stage, and the MVD of E group was higher than that of control group.Conclusion Vascularized bone flap can stimulate vascular during bone allograft.

【Key words】 Bone flap;Bone allograft;VEGF;MVD

作者单位:516000广东省惠州协和医院(赵军 李云杰);深圳市南岭医院(徐海锦);湖北蒲纺集团医院(张峰)

异体骨移植现已成为治疗骨缺损、骨不连的重要手段。血管化、骨再生、骨端融合是三个密切相关的环节,血管化是最初也是最基本的环节,血管的形成,恢复血供是骨折修复的前提。本实验通过建立带血供骨膜瓣包裹同种异体骨修复兔大段骨缺损的模型,选取Ⅷ因子相关抗原作为微血管的特异性标记,探讨移植物再血管化的过程,旨在为临床应用提供基础研究的资料。

1 材料与方法

1.1 材料 日本大耳白兔,6～10月龄,体质量2.0～2.6 kg,共48只,雄16只为供体,雌32只为受体。实验分为实验组16只(带血管蒂骨膜瓣包裹同种异体骨移植组)和对照组16只(异体骨移植组)。若动物出现意外死亡,则酌情补齐。

1.2 方法 供体的切取及制备:麻醉下取雄兔股骨干2.5 cm,去除骨膜、骨髓,生理盐水反复冲洗,经无菌密封保存于4℃ 12 h,再经-30℃降温2 h,最后储存于-196℃的液氮中保存2周。

模型的制作:受体兔麻醉后,取股内侧切口,分离并保护股血管及其分支,将薄层肌袖同骨膜保存,截除股骨干2.5 cm造成皮质骨缺损,将已制备的长管状同种异体骨按两步解冻法解冻,原位植入受体动物骨缺损处,直径2.0 mm的克氏

针固定,将骨膜瓣包裹移植物,分层缝合伤口,不予以外固定,术后静脉注射青霉素钠40万U/d抗感染治疗一周。对照组是在截取股骨干时连同骨膜及周围部分肌肉一并切除,其余手术步骤同实验组。

标本处理:分别于术后4、8、16周处死动物,并将移植骨和周围组织一起取材。常规HE染色,免疫组织化学染色(S-P法)。

MVD计数:低倍镜(40×)下寻找三个血管密度相对较高区域,然后分别计数其高倍视野(200×)MVD最大值,并取平均值。

1.3 统计学分析 采用SPSS 11.5统计分析软件,所有数据以(x±s)表示,利用单因素方差分析对MVD的检测结果进行组间分析,P

2 结果

2.1 组织化学观察结果 术后4周骨组织切片HE染色显示实验组哈佛氏管扩大,其内可见血管和活的细胞成分,周边骨旋涡排列有规律,其内可见骨细胞,对照组哈佛氏管未见明显扩大,其内少见细胞成分,周边骨旋涡排列紊乱,中央空虚,无细胞结构。术后8周实验组哈佛氏管内出现新生血管增加,同时有新生骨单位形成,而对照组仅出现少量新生血管,术后16周,实验组出现大量新生的骨单位,对照组则少见(图1、2) 。

图1实验组术后4周骨组织切片HE染色结果(×400)

图2 对照组术后4周骨组织切片HE染色结果(×400)

图3 实验组术后4周VEGF免疫组织化学表达(×200)

图4 对照组术后4周VEGF免疫组织化学表达(×200)

图5 实验组术后4周,移植骨骨周组织和骨痂的微小血管密度较高(×200)

图6 对照组术后4周,移植骨骨周组织和骨痂的微小血管密度较低(×200)

2.2 VEGF免疫组织化学观察术后4周,VEGF在骨组织和骨痂中的成骨细胞、成软骨细胞、肥大的软骨细胞和成纤维细胞均呈强阳性染色。对照组呈现出同样的规律,但表达强度较弱;术后8周在成熟软骨细胞、肥大软骨细胞和成骨细胞中VEGF呈持续阳性表达,对照组呈弱阳性表达;术后16周两组VEGF的表达皆呈弱阳性,破骨细胞着色较深,实验组的表达强度仍强于对照组(图3、4)。

2.3 MVD的观察与比较Ⅷ因子相关抗原多克隆抗体与血管内皮细胞表达的Ⅷ因子相结合,标记新生血管的数量。表1显示,术后4周,实验组MVD明显高于对照组(P

表1

两组动物骨周组织及骨痂血管密度的比较(x±s)

组别术后时间

4周8周16周

对照组16.37±0.9913.85±1.6215.88±1.22

实验组27.58±1.33*24.36±1.56*22.46±1.05*

注:与对照组比较,*P

3 讨论

VEGF具有强大、特异性促血管内皮细胞增生和血管生成作用,是促血管再生的最终通道。其他因子的促血管生成作用是全部或部分通过VEGF的作用得以实现[1]。Ⅷ因子相关抗原被认为是血管最特异的标记物。VEGF对体外培养的成骨细胞无增殖的作用,但能引发成骨细胞的迁移及分化,且引起成骨细胞迁移及分化所需的浓度比骨形态发生蛋白还低100倍,从而推测VEGF在骨折愈合中可能起重要作用[2]。本实验中利用免疫组织化学染色的方法对血管内皮细胞表达的Ⅷ因子相关抗原进行染色,反映骨周组织新生血管的变化。从对照组结果得知,术后4周,新生微血管生成已达到高峰,实验组MVD明显高于对照组,术后8、16周,血管生成逐渐减少,但实验组MVD仍明显高于对照组。从VEGF的免疫组化染色可以看出在相同时段,实验组表达明显强于对照组,与MVD的计数结果相似,提示VEGF的表达对血管生成,乃至骨缺损的修复愈合起着重要作用。

带血供骨膜瓣内含有各种有利于成骨的细胞,骨膜具有极大的骨生成作用。同时,血运的建立有利于废物的清除和新骨的形成。骨膜瓣内本身会产生大量活化的细胞因子,血运的建立,能不断激活和补充成骨因子和促进血管生成的因子,带血供骨膜包裹异体骨,可以较快地使移植物纳入与宿主一致的生理反馈模式中,因此具有良好的骨生成、骨传导及骨诱导的作用,本实验结果发现带血供骨膜包裹异体骨能促进血管内皮细胞生长因子的表达,从而使得新生微血管的数量增加,大大缩短了骨缺损的修复时间,促进骨缺损的愈合。

参 考 文 献

[1] Frelin C,Ladoux A,D’angelo G,et al.Vascular endothelial growth fractors and angiogenesis.Ann Endocrinol Paris,2000,61(1):70-74.

[2] Spector JA,Mehrara BJ,Greenwald JA,et al.Os-teoblast expression of vascular endothelial growth factor is modulated by the extracellular microenvi-ronment.Am J Physiol Cell Physiol,2001,280(1):C72.