热痹康汤对胶原诱导性关节炎大鼠滑膜P38/NF―κB信号通路的影响

【前言】热痹康汤对胶原诱导性关节炎大鼠滑膜P38/NF―κB信号通路的影响由文秘帮小编整理而成，但愿对你的学习工作带来帮助。1 实验材料 1.1 实验动物 实验用SPF级雌性Wistar大鼠 60只，体质量（110±10）g，购自广西中医药大学实验动物中心，动物合格证号：桂医动字第11005号。不限制饮水和进食，适应性鼠颗粒饲料饲养1周后，按计划进行各项实验。 1.2 试 剂 牛Ⅱ型胶原蛋白（南京奥多福尼生物...

【摘 要】目的：观察清热解毒抗风湿方药――热痹康汤对胶原诱导性关节炎（CIA）大鼠滑膜p38/核转录因子-κB（nf-κB）信号通路的影响。方法：将60只SPF级雌性Wistar大鼠随机分为空白对照组，模型对照组，热痹康汤低、中、高剂量组，甲氨蝶呤组，每组10只。除空白对照组外，其余各组大鼠采用弗氏不完全佐剂乳化的牛Ⅱ型胶原蛋白诱导CIA大鼠模型。造模成功后开始给药，模型对照组予生理盐水灌胃，热痹康汤低、中、高剂量组分别给予热痹康汤提取物低、中、高剂量灌胃，甲氨蝶呤组给予甲氨蝶呤腹腔注射，空白对照组大鼠自由饮水和进食。观察不同剂量热痹康汤对CIA大鼠滑膜P38/NF-κB信号通路的影响。结果：热痹康汤能下调CIA大鼠滑膜P38/NF-κB信号通路相关分子P38 MAPK、NF-κB/P65、IκBα的表达。结论：热痹康汤治疗类风湿关节炎的作用与抑制滑膜P38/NF-κB信号通路有关。

【关键词】 胶原诱导性关节炎；关节炎，类风湿；热痹康汤；P38 MAPK；NF-κB；大鼠

【ABSTRACT】Objective：To observe the effect of Rebikang Tang（热痹康汤）on the P38/NF-κB signal pathway in synovial membrane of rats with arthritis induced by collagen（CIA）.Methods：Sixty female Wistar rats of grade SPF were randomly divided into a blank control group，a model control group，low，middle and high dose Rebikang groups，and a methotrexate group，10 rats in each group.Except the blank control group，the rats in the other groups were induced by typeⅡ collagen to establish CIA rat models.Rat models in the model control group were given intragastric administration of physiological saline.Models in the low，middle and high dose Rebikang groups were given intragastric administration of low，middle and high dose of Rebikang Tang.Rat models in the methotrexate group were given intraperitoneal injection of methotrexate.Rats in the blank control group were only fed with water and food.Effect of Rebikang Tang on the P38/NF-κB signal pathway in each group was observed.Results：Rebikang Tang could down-regulate the expression of related molecules P38 MAPK，NF-κB/P65 and IκBα of the P38/NF-κB signal pathway in synovial membrane of CIA rats.Conclusion：The role of Rebikang Tang in the treatment of rheumatoid arthritis is related to the inhibition of the P38/NF-κB signal pathway in synovial membrane.

【Keywords】 collagen-induced arthritis；arthritis，rheumatoid；Rebikang Tang（热痹康汤）；P38 MAPK；NF-κB；rats

类风湿关节炎（rheumatoed arthritis，RA）的病因迄今尚未完全明确，未经系统规范治疗将会出现关节破坏和功能丧失。核转录因子-κB（NF-κB）作为信号转导的枢纽，在RA等免疫相关性疾病的发病过程中发挥重要作用，而P38丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）在该细胞信号传导通路中起着重要的中介作用，可能成为RA治疗的新靶点。本实验拟通过热痹康汤对CIA大鼠滑膜细胞P38/NF-κB信号通路影响的研究，进一步明确其治疗RA的作用原理。

1 实验材料

1.1 实验动物 实验用SPF级雌性Wistar大鼠

60只，体质量（110±10）g，购自广西中医药大学实验动物中心，动物合格证号：桂医动字第11005号。不限制饮水和进食，适应性鼠颗粒饲料饲养1周后，按计划进行各项实验。

1.2 试 剂 牛Ⅱ型胶原蛋白（南京奥多福尼生物科技有限公司）；不完全弗氏佐剂（美国Sigma公司）；P38 MAPK、NF-κB/P65、IκBα检测试剂盒（瑞士Roche公司）；水合氯醛（美国Life technologies公司）；冰醋酸[生工生物工程（上海）有限公司]。

1.3 实验药物 注射用甲氨蝶呤（MTX，5 mg，广州岭南制药有限公司，国药准字H20054692）。热痹康汤提取物（RBK）是使用乙醇对热痹康汤（秦艽10 g、防风10 g、桂枝4 g、威灵仙15 g、制川乌6 g、地龙10 g、桑枝10 g、葛根15 g、忍冬藤20 g、青风藤10 g、黄柏10 g、苍术10 g）进行萃取、溶解并提取上清液制成，实验前按比例加入乙醇和生理盐水进行溶解配制备用，具体由本院新药研发中心制备。

2 方 法

2.1 实验造模及分组 将所有大鼠放置于鼠笼中进行适应性饲养，观察7 d后随机分为空白对照组，模型对照组，热痹康汤低、中、高剂量组，MTX组，每组10只。除空白对照组外，其余各组大鼠参照文献[1]方法依次进行实验造模：在无菌实验条件下，用冰醋酸充分溶解牛Ⅱ型胶原蛋白（操作于冰面上进行），随后把它和等体积的弗氏不完全佐剂一起注入医用三通管内，用注射器互相推吸充分混合乳化成油包水状，即成CⅡ乳剂，放置4 ℃冰箱保存过夜备用。进行造模时，分别于大鼠背、尾部皮内多点注射CⅡ乳剂，14 d后再次注射CⅡ乳剂进行免疫（方法和剂量同前）。评分在4分以上，大鼠四肢足爪均严重肿胀、踝关节直径增长幅度≥2 mm则为造模成功。本次实验中大鼠造模全部成功，并且没有死亡大鼠。

2.2 药物干预 造模成功后开始给药，模型对照组予生理盐水2 mL・（100 g）-1灌胃，每日

1次；MTX组以MTX 5 mg溶于10 mL生理盐水为

0.5 mg・mL-1，按70 kg人体质量与200 g大鼠换算系数为0.018，按MTX每周1.9 mg・kg-1腹腔注射给药；热痹康汤高剂量组予RBK31.25 g・（100 g）-1・d-1

灌胃，中剂量组予15 g・（100 g）-1・d-1灌胃，低剂

量组予7.5 g・（100 g）-1・d-1灌胃，每日分2次进行；空白对照组大鼠自由饮水和进食。

2.3 取材及组织处理 28 d后，所有大鼠以水合氯醛进行腹腔注射，迅速麻醉后颈椎脱臼法处死，逐层分离膝关节各层组织，打开关节腔，可见由髌骨下极向下延续有一层浅淡黄色平滑光亮的滑膜组织，用手术刀片小心切下，再用眼科直镊进行钝性分离并完整剥离滑膜组织，冰冻保存备测。

2.4 P38和NF-κB检测 实验中采用Western blot 法依次检测各组大鼠关节滑膜细胞P38MAPK、NF-κB/P65、IκBα的表达，所有操作严格按照说明书进行，步骤如下：于低温下将各组大鼠关节滑膜组织进行匀浆，随后加入适量蛋白裂解液，放置于冰上40 min，置入12 000 r・min-1离心机进行离心后取上清。以BSA 为标准对照，应用Bradford 法对上清进行蛋白定量。选取20 μg蛋白样品，10% SDS-PAGE电泳，100 V转移1 h至硝酸纤维素薄膜上，一起放入封闭液中37 ℃封闭1 h；一抗4 ℃过夜。实验中采用不含抗体TBS-T液孵育作为阴性对照。多次反复洗膜后，将膜与碱性磷酸酶标记的抗IgG抗体进行孵育，轻轻摇荡1 h（室温下进行），再次洗膜后，用Western blot印迹进行观察研究，最后采用图像分析测定各带吸光度（A）值作定量分析，作出结果判断。

2.5 统计学方法 采用SPSS 17.0软件进行统计分析。计量资料以表示，采用方差分析或t检验对各组间资料进行比较。以P < 0.05为差异有统计学意义。

3 结 果

与空白对照组比较，模型对照组大鼠的滑膜细胞P38 MAPK、NF-κB/P65、IκBα的表达量均有不同程度的升高（P < 0.05）。与模型对照组比较，热痹康汤各治疗组与MTX组大鼠滑膜细胞P38 MAPK、

NF-κB/P65的表达量均有降低（P < 0.05或P < 0.01）。低剂量RBK对大鼠滑膜细胞IκBα无明显抑制作用，高、中剂量RBK与MTX对大鼠滑膜细胞IκBα的表达均有抑制作用。见图1、表1。

4 讨 论

RA的发病过程中存在着众多细胞因子的参与，P38/NF-κB信号通路在细胞因子的激活过程中起着“开关”作用，研究表明，P38 MAPK是炎性细胞应答过程中最重要的家族成员之一，

P38 MAPK信号传导通路可被多种刺激因子激活，可参与细胞的多种生理过程[2]。研究资料证实，P38 MAPK可调控与RA骨侵蚀有关的破骨细胞的

分化[3]。

NF-κB与抑制物IκB结合以后存在于细胞质当中，但其本身没有活性，主要通过降解IκB而激活[4]。NF-κB活化后启动炎症递质基因的转录，诱导IκB的表达增强，新生的IκB进入细胞核后与NF-κB反应，使NF-κB从DNA上解离并转移到胞浆中，变成无活性状态，IκB还与游离的NF-κB结合，抑制其活化[5]。研究表明，体内NF-κB信号通路的活化过程调控是通过经细胞外的正反馈途径以及经细胞内、外的负反馈途径实现的[6]。

NF-κB的调控与活化在RA的病理变化占有重要地位。在RA发病的过程中，肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素（IL）-1、IL-2、IL-8等致炎细胞因子均是通过NF-κB信号通路，激活相关因子，参与免疫应答过程，诱发炎症反应，导致关节的损伤。本次实验研究发现，在致炎后的胶原诱导性关节炎大鼠中NF-κB的活性明显升高，结果提示，NF-κB参与了胶原诱导性关节炎的炎症调控过程。有研究表明，NF-κB表达增加与MAPK信号传导系统有关，如TNF-α和IL-1等通过与细胞膜上的受体结合，进而激活中性鞘磷脂酶，再进一步活化神经酰胺活化蛋白而激活MAPK通路，诱导NF-κB的表达而产生炎性因子[7]。因此，抑制P38/NF-κB信号通路的活化成为RA新的治疗

靶点。

RA属中医学“痹病”“历节病”等范畴，多因禀赋不足，人体正气亏虚，卫外不固，或病后、产后腠理疏松，感受湿热之邪，痹阻肌肉、经络，气血凝滞而致。本虚标实是本病的病理性质，本虚为气血、阴阳、脏腑亏损，标实为外受湿热之邪。热痹康汤是笔者根据多年临床体会总结的经验方，具有清热解毒、利湿除痹止痛功效，前期临床应用表明具有较好的疗效，无明显毒副作用[8]。前期课题研究发现，热痹康汤能降低CIA大鼠血清IL-1β、IL-2、IL-6、TNF-α及基质金属蛋白酶-3水平，升高IL-4、IL-10的水平[9-12]。

本研究结果提示，热痹康汤对P38 MAPK、NF-κB/P65以及IκBα的表达均有抑制作用，其抑制作用呈剂量依赖型，能下调CIA大鼠滑膜P38/NF-κB信号通路的表达，这一研究结果为热痹康汤对RA的靶向治疗及临床研究提供一定的实验依据。

5 参考文献

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收稿日期：2016-08-24；修回日期：2016-09-22