运用液液萃取-高效液相色谱法对粮食中黄曲霉毒素测定的研究

【摘要】 目前使用的黄曲霉毒素测定方法普遍存在着操作复杂、经济成本高等问题,运用液液萃取-高效液相色谱法,以C18反相色谱柱进行分离,并运用柱后碘衍生荧光检测器检测,并经12个样品检测验证,检测方式没有明显的干扰杂质,操作性强,回收率高,准确性高,经济性强。

【关键词】 液液萃取-高效液相色谱法;黄曲霉毒素测定;分析研究

在自然界中,黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2属于较为稳定的真菌毒素,属于黄曲霉菌以及寄生曲霉菌的代谢物,具有较强的毒性,对人体危害性较高[1]。强化对粮食中B1、B2、G1、G2的检测,一直是各国食品安全工作的重要内容,本研究运用优化的液-液萃取精华前处理过程,研制出简便易行的液相检测方式,具有一定的推广与运用价值,本文主要进行简要论述。

1 材料和方法

1.1 材料

仪器设备:美国安捷伦公司出品的高效液相色谱仪配荧光检测器(Agilent 1100)、柱后衍生仪器、氮吹仪、旋涡混合器(XH-B)、离心机、高速均质器、砻谷机、锤式旋风磨,以及色谱柱(Eclipse Plus C18 5um,4.6mmx250mm)。

试剂:乙睛(色谱纯)、甲醇(色谱纯),黄曲霉毒素混合标准品,氯化钠(分析纯),二氯甲烷(分析纯)、三氯甲烷(分析纯),超纯水。

黄曲霉毒素标准曲线:黄曲霉毒素G1、G2、B1、和B2的混合标准储备溶液(1mL),其中G2、B2以及G1、B1的质量浓度分别为0.3ug/mL和1.0ug/mL。

图5 稻谷、小麦、玉米色谱分离干扰分析比较图

备注:本图中实线为加样品色谱图,虚线为空白样品色谱图。

黄曲霉毒素B1,B2,G1和G2的混合标准工作溶液:将上述混合标准储备溶液以50%比例甲醇进行配比,分别配制出质量浓度为0.15、0.3、1.5、3.0、6.0ug/L的黄曲霉毒素G2,B2混合标准溶液,质量浓度为0.45、0.9、4.5、9.0、18ug/L的黄曲霉毒素G1,B1混合标准溶液。粮食试验品为本地区质监机构提供。

1.2 方法

样品制备:取稻谷、玉米、小麦各1000g,予以脱壳粉碎并混匀,粒度小于2mm为宜。

样品提取:取氯化钠4g、80%比例甲醇溶液以及20g样品,装在搅拌杯中进行快速搅拌2min,并静止相同时间后将提取物经快速滤纸、玻璃纤维滤纸分别过滤后备用。

样品净化:将1 mL滤液加入300uL三氯甲烷进行匀振,注入带塞玻璃离心管(事先注入3mL水),并进行离心分层(3min,4000r/min),将上层液体移去,然后加入300uL三氯甲烷进行两次匀振提取,将下层萃取液以氮气吹干,以50%比例的甲醇溶液500uL将其溶解,以0.45um有机相膜实施过滤,滤液备用[2]。

色谱条件:色谱柱(Eclipse Plus C185 um,4.6mmx250mmid);流动相:甲醇:乙睛:水(8:1:11),0.8,mL/min流速,20uL进样量,30摄氏度柱温,荧光检测器检测波长为Ex360nm,Em450nm。柱后衍生化系统为0.05%浓度碘溶液、0.3 mL/min流速和70℃反应管温度。

定性定量方法以标准物质保留时间对样品峰开展准确定性,取外标法以峰面积进行宗量计算,配比相应浓度溶液实施分析,并绘制标准曲线(质量浓度为横坐标,峰面积为纵坐标)[3]。

2 结果

2.1 实验条件

2.1.1 液-液萃取溶剂及用量确定

对比二氯甲烷、三氯甲烷萃取黄曲霉毒素效果进行比较,分别以200uL萃取试液加入1mL水进行外标法加标回收实验,结果如下表1:

可见运用三氯甲烷萃取方式加标实验回收率较高,其可以确定为实验试剂。

取100-700uL剂量三氯甲烷试剂溶液进行萃取,加标回收实验结果如下图1:

可见,从实验精准度以及经济性方面综合考虑,试剂溶液用量应当确定为300uL。

2.1.2 液-液萃取加水量优化

以上述实验确定的试剂以及剂量进行实验(300uL三氯甲烷萃取),分别从1-9mL开始加水,外标法得加标回收实验结果如下图2:

可见选取加水量为3mL较为合适。

2.1.3 流动相与流速优化

对甲醇+水(4:1)、甲醇+水(9:11)、甲醇+乙睛+水(8:1:11)等几种流动相分析,可知甲醇+乙睛+水(8:1:11)状态下黄曲霉毒素G2、G1、B2和B1色谱峰峰形优于其余流动相,成分分离效果较好,未出现拖尾。在0.5-1.0mL/min区间进行流速变化,可见0.8mL/min状态下峰形较好。在这一状态下,标准品与阳性样品分离色谱图如下图3、4。

2.1.4 三种粮食干扰状况分析

因为不同种类的粮食作物因为自身品种以及生长环境以及储藏条件等方面的差异性,对黄曲霉毒素产生的含量也存在差异性,本文对稻谷、小麦以及玉米三种粮食作物采取最恰当的色谱条件以及萃取方法进行试验。具体黄曲霉毒素分离状况见下图5:

由上图可见,本实验方式与色谱条件能够较好地排除了杂峰对目标峰的干扰作用,色谱图较为优质。

2.2 方法的线性范围以及检出限

在规定色谱状态下,测定不同质量浓度的黄曲霉毒素G2、G1、B2以及B1混合标准溶液,以峰面积对各组分质量浓度开展定量作图。黄曲霉毒素G1和B1、G2和B2分别在质量浓度为0.45-18、0.15-6 ug/L-1区间内线性关系较好,相关系数超过0.9995,线性方程和相关系数见下表2:

进空白样,并以基线3倍噪声值查询计算,黄曲霉毒素G2、G1、B2、B1方法检出限为0.39ug/kg、0.15ug/kg、0.3ug/kg、0.2ug/kg。

2.3 方法回收率与精密度

以20g为基准,称取空白样品18份,以不同弄不配置,按照本方式进行提取、净化与测定,回收率见下表3:

由上表可以看出,加标回收率在80.3-97%范畴,相对标准偏差不超过4%,验证了检测方式的精准度较高。

2.4 样品检测

按照本实验检测标准与条件,对榆木、小麦以及稻谷12个样品进行黄曲霉毒素含量检测,结果如下表4:

3 结语

本实验研究确定了粮食中黄曲霉毒素的高效液相色谱快速测定方式,运用本检测方式经优化的液-液萃取精华,以C18反相色谱柱进行分离,并运用柱后碘衍生荧光检测器检测,经12个样品检测验证,本检测方式没有明显的干扰杂质,操作性强,回收率高,准确性高,经济请强,具有较大推广价值。

参考文献:

[1]刘岚.粮油食品中黄曲霉毒素检测方法[J].农产品加工,2010(04).

[2]马良,李培武,张文.高效液相色谱法对农产品中黄曲霉毒素的测定研究[J].分析测试学报,2007(06).

[3]马良,李培武,张文,丁晓霞,谢立华,姜俊.食用油中黄曲霉毒素B1免疫亲和检测技术研究[J].中国油脂,2007(04).