杨树高活性叶绿体提取条件的分析和研究

中图分类号 Q244-3;S792.117 文献标识码 A 文章编号 1007-5739(2013)15-0170-02

光合作用是林木生长的物质基础,也是提高林业产量的技术措施的核心,一直是树木生理学的主攻方向之一。叶绿体是进行光合作用的细胞器,要研究光合作用常常需要从叶绿体水平入手。例如,研究快速生长的林木高光效的原因,就需要从叶绿体水平来分析,为相关的分子生物学提供思路;比较多种树木光合功能的差异也往往需要从叶绿体水平来分析。因此,研究树木的光合作用光反应机制更离不开叶绿体提取技术。

杨树是我国种植面积最大的树种,在我国林业生产中具有重要的地位。由于杨树叶片的角质层较厚,次生代谢物较多,树木的叶绿体提取难度显着大于菠菜等蔬菜。如何提取高活性叶绿体成为了限制杨树光合作用研究的技术瓶颈。目前,提取叶绿体的常用方法主要是密度梯度离心法。本试验以幼嫩的杨树叶片为试验材料,通过配制具有不同蔗糖浓度梯度和pH值梯度的捣碎液提取叶绿体,然后再测定所提叶绿体的荧光动力学参数,通过比较,筛选出叶绿体活性最大时捣碎液的蔗糖浓度和pH值,为杨树叶绿体的提取提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试杨树(毛白杨,Populus tomentosa)叶片在5月初采摘,此时的杨树叶片刚刚成熟,比较幼嫩且光合活力最高。叶片采摘后,立即用清水洗净后再用蒸馏水冲洗,然后去除中脉,留下叶片中含叶绿体较多的部分,置于冰箱中4 ℃暗适应过夜,以消耗过多的淀粉。

1.2 试验方法

1.2.1 叶绿体的提取。叶绿体的提取过程均在4 ℃和黑暗中进行。暗适应过夜的叶片用捣碎液在电动捣碎机中捣碎,经过4层纱布和16层纱布2次过滤后,以220×g离心2 min,去除沉淀;上清液以1 200×g离心后得到的沉淀即为叶绿体。捣碎液中含有20 mmoL/L Tris、15 mmoL/L NaCl、2 mmoL/L EDTANa2,蔗糖浓度分别为0、200、400、600、800 mmoL/L,pH值用HCl和NaOH调至5~10。

将沉淀所得的叶绿体用保存液(20 mmoL/L Mes,pH值6.5;0.4 moL/L蔗糖;35 mmoL/L NaCl)悬浮,匀浆。调叶绿素浓度为1.5 mg/mL,分装后用液氮速冻,最后在-70 ℃保存。叶绿素浓度测定参照张其德(1985年)的方法[1],取10 μL叶绿体悬浮液,用80%的丙酮5 mL稀释,以5 000×g离心后测定上清液中叶绿素浓度。

1.2.2 叶绿体荧光活性的检测。叶绿体暗适应30 min以后,把叶绿体色素浓度稀释为750 μg/mL,然后取500 μL于测量小管中,用PEA(Plant Efficiency Analyser;Hansatech Instru-ment Ltd.,UK)测定叶绿体的叶绿素荧光活性。测定光源为3个发光二极管提供的波长650 nm的红光,光照强度为3 000 μmoL/(m2·s),使光聚集在直径为4 mm的试验材料上,荧光信号的记录时程为2 s。Fv/Fm表示光系统Ⅱ(Photo-system Ⅱ,PSⅡ)最大或潜在光化学效率;Fv/Fo代表PSⅡ活性状态;Fm/Fo用来表示通过PSⅡ的电子传递情况[2]。每个处理设置6个重复。

2 结果与分析

2.1 不同浓度捣碎液对叶绿体活性的影响

从图1可以看出,蔗糖的浓度影响Fv/Fm。当蔗糖的浓度小于400 mmoL/L时,随着蔗糖浓度的增加,Fv/Fm逐渐增大。当蔗糖的浓度为400 mmoL/L时,荧光参数Fv/Fm达到最大,比蔗糖的浓度为0 mmoL/L时高出12%。当蔗糖的浓度大于400 mmoL/L时,随着蔗糖浓度的增加,Fv/Fm逐渐减小。

从图2可以看出,Fv/Fo也受蔗糖浓度的影响。当蔗糖的浓度小于400 mmoL/L时,随着蔗糖浓度的增加,Fv/Fo逐渐增大。当蔗糖的浓度为400 mmoL/L时,Fv/Fo最大,比蔗糖的浓度为0 mmoL/L时高出34%。当蔗糖的浓度大于400 mmoL/L时,随着蔗糖浓度的增加,Fv/Fo逐渐减小。蔗糖的浓度也影响Fm/Fo。当蔗糖的浓度小于400 mmoL/L时,随着蔗糖浓度的增加,Fm/Fo逐渐增大。当蔗糖的浓度为400 mmoL/L时,Fm/Fo最大,比蔗糖的浓度为0 mmoL/L时高出22%,当蔗糖的浓度大于400 mmoL/L时,随着蔗糖浓度的增加,Fm/Fo又逐渐下降(图3)。

2.2 不同pH值的捣碎液对叶绿体活性的影响

从图4可以看出,捣碎液的pH值影响Fv/Fm。当捣碎液的pH值小于9时,随着捣碎液pH值的增大,Fv/Fm逐渐增大。但这当pH值为8时,Fv/Fm有所下降,可能是提取时由于操作误差引起的。当捣碎液的pH值达到9时,Fv/Fm最大。说明此时PSⅡ的潜在光化学效率最高。当捣碎液的pH值为10时,Fv/Fm又减小。

从图5可以看出,捣碎液的pH值也影响PSⅡ的潜在活性。当捣碎液的pH值小于9时,随着捣碎液pH值的增大,Fv/Fo逐渐增大。当捣碎液的pH值为9时,Fv/Fo最大,比pH值为5时高出30%。即此时PSⅡ的潜在活性最大。

Fm/Fo也受捣碎液的pH值的影响,变化规律与Fv/Fm和Fv/Fo类似。当捣碎液的pH值为9时,Fm/Fo达到最大,说明PSⅡ的电子传递速率最快。当捣碎液的pH值为10时,Fm/Fo又减小,说明电子传递受到影响(图6)。

3 结论与讨论

在提取杨树叶片叶绿体时,所用捣碎液中的蔗糖浓度为400 mmoL/L,捣碎液的pH值为9时,Fv/Fm、Fv/Fo、Fm/Fo均最大。这说明在提取叶绿体时,捣碎液中的蔗糖浓度和捣碎液的pH值对叶绿体的活性具有十分重要且明显的作用。蔗糖的浓度和捣碎液的pH值过高或过低从而使Fv/Fm、Fv/Fo、Fm/Fo下降,说明PSⅡ在提取过程中受到了破坏,其光化学效率下降,能量转换受到影响[3]。

在提取叶绿体的过程中,捣碎液中的蔗糖浓度能够影响叶绿体的活性,是因为蔗糖的浓度能够影响叶绿体的渗透势。因此,在试验前应首先测定植物材料的渗透势,根据渗透势选择合适的提取浓度,经已经测定杨树叶片的可溶性物质总摩尔浓度为500 mmoL/L左右。当蔗糖的浓度为400 mmoL/L时,叶绿体内外的渗透势相差不大,因此叶绿体既不吸水也不失水,此时活性最高。当蔗糖的浓度大于400 mmoL/L时,蔗糖的水势低于叶绿体的水势,这样叶绿体中的水分向外渗透,叶绿体会萎缩破裂,因此叶绿体由于失水从而活性降低。相反,当蔗糖的浓度小于400 mmoL/L时,蔗糖的水势高于叶绿体的水势,叶绿体由于吸水膨胀破裂也会使其活性降低。

捣碎液的pH值也影响叶绿体的活性。叶绿体中含有多种酶和蛋白质,尤其是暗反应需要各种酶的催化,例如,核酮糖-1,5-二磷酸羧化加氧酶、3-磷酸甘油酸激酶、甘油醛-3-磷酸脱

氢酶等。另外,在光反应中,电子传递也需要各种蛋白质的参与,pH值也能影响这些蛋白质的活性。因此,pH值过高或过低,都能降低Fv/Fm、Fv/Fo、Fm/Fo的值,从而使叶绿体的活性降低[4-6]。

4 参考文献

[1] 张其德.测定叶绿素的几种方法[J].植物学 通报,1985(3):60-64.

[2] STRASSER R,SRIVASTAVA A,TSIMILLI-MICHAEL M.The fluores-cence transient as a tool to characterise and screen photosynthetic samples[M]// JUNUS M,PATHRE U,MOHANTY P.Probing Photosy-nthesis:Mechanisms,Regulation and Adaptation.London and New York:Taylor and Francis,2000:445-483.

[3] ALLAKHVERDIEV S I,HAYASHI H,NISHIYAMA Y,et al.Glycine-betaine protects the D1/D2/Cytb559 complex of photosystem II against photo-induced and heat-induced inactivation[J].Journal of Plant Physio-logy,2003(160):41-49.

[4] 王思远,崔喜艳,陈展宇,等.土壤pH值对烤烟叶片光合特性及体内保护酶活性的影响[J].华北农学报,2005(20):11-14.

[5] 梁智凯.植物叶绿体基因工程发展探析[J].现代农业科技,2010(3):28-29.

[6] 李晓洁.完整叶绿体提取方法的优化探讨[J].科技信息,2010(10):771-772.