微柱凝胶技术在检测新生儿溶血病中的应用

【摘要】 新生儿溶血病（HDN）由母婴血型不合引起，是一种免疫性溶血性疾病，可导致新生儿黄疸、贫血、水肿、肝脾肿大、死胎等。本文简述了微柱凝胶技术在新生儿血型血清学检测中的应用，对于HDN的早期诊断、早期治疗、预防和降低新生儿溶血病的发生具有重要的意义。

【关键词】 新生儿溶血病； 微柱凝胶技术； 血清学检测

Application of Micro-column Gel Technique in the Detection of Hemolytic Disease of the Newborn/SU Ming-li.//Medical Innovation of China，2014，11（32）：154-156

【Abstract】 Hemolytic Disease of the Newborn （（HDN），caused by maternal-fetal blood group incompatibility，is an autoimmune hemolytic disease which can lead to neonatal jaundice， edema， anemia， hepatosplenomegaly， stillbirth， etc.This paper discusses the application of micro-column gel technique in the detection of neonatal blood group serology of the newborn， which is of significance for the early diagnosis and early treatment of HDN，thus preventing and reducing the occurrence of Hemolytic Disease of the Newborn.

【Key words】 Hemolytic Disease of the Newborn； Micro-column gel technology； Serological detection

First-author’s address：Affiliated Hospital of Guilin Medical College， Guilin 541001，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2014.32.055

新生儿溶血病（HDN）是母婴血型不合引起的胎儿或新生儿免疫性溶血性疾病。临床上以母婴ABO新生儿溶血病为最多见，其次为Rh新生儿溶血病。其发病条件是母体曾接受异种抗原刺激，产生相应的免疫抗体，这些抗体可通过胎盘进入胎儿体内，与胎儿红细胞反应，使胎儿红细胞遭到破坏出现新生儿黄疸、贫血、水肿、肝脾肿大，甚至死胎、新生儿死亡等溶血病的症状和合并症。所以HDN试验的准确性和敏感性对疾病的诊断和治疗至关重要。近年来，MGT在国内外输血界已逐渐作为常规应用，其原理是戴安娜微柱凝胶卡孔内填充的是大分子葡聚糖，间隙非常微小，通过微柱凝胶的微孔过滤作用和抗原抗体特异性反应作用，经低速离心后，抗原抗体凝集反应形成大分子物质阻滞于凝胶上层，呈阳性，而单个红细胞具有变形性，可穿过微孔到达凝胶底部，呈阴性反应，它克服了传统的抗人球蛋白试管法需要反复洗涤的缺点。因其操作简便、灵敏度、准确度高、标本用量少、结果保存时间长、易于标准化，而逐渐成为临床上真正的金标准，目前已经应用于血型免疫学的相关检测，如ABO血型和Rh 血型鉴定、交叉配血、新生儿溶血病的血清学检查、不规则抗体的筛选及鉴定、血小板同种抗体筛选等血清学试验。本文将微柱凝胶技术在新生儿溶血病血清学检测中的应用进行综述。

1 HDN的发病机制

1.1 ABO新生儿溶血病 发病者的母亲多数为O型，具有免疫性抗A及抗B抗体；婴儿多数是A型及B型。是由于母亲其抗A、抗B抗体除了属于IgM的天然抗体外，同时还有IgG的免疫性抗体。而IgM抗体是不能通过胎盘的。免疫性抗A或抗B抗体（IgG）则可通过胎盘，抗体进入胎儿体内后，附着于胎儿相应红细胞膜上，与其抗原发生免疫反应而溶血。A型血的新生儿发生ABO血型不合致新生儿溶血病的概率大于其他血型。A（B）型母亲血清中则主要是抗B（A）IgM抗体，极少有抗B（A）IgG，母亲A（B）型，胎儿B（A） 型或AB型很少发生溶血病。ABO溶血病可以第一胎发病。

1.2 Rh新生儿溶血病 是由母婴Rh血型不合，产生的Rh抗体作用于胎儿红细胞造成红细胞破坏引起的高胆红素血症。与ABO溶血病比较，症状较重。Rh新生儿溶血病一般在第2胎以后发病，因Rh抗体是免疫性抗体，第一次怀孕虽然婴儿可能为Rh阳性，但其血清中没有天然存在的Rh抗体，因此一般不会发病。Rh血型系统有5种抗原，抗原性强弱为D>E>c>C>e。Rh血型系统中以D免疫原性最强，以D抗原不和[1]为最多见，其次为E、c、C、e。

2 HDN的血型血清学检测

2.1 新生儿及父母血型鉴定方法 准确的血型鉴定是临床安全输血的前提和保证。试管法是传统经典的ABO、RhD血型抗原鉴定方法，其结果准确可靠，但与MGT相比，操作难以规范化、自动化，检测结果不易保存，而MGT易于自动化、标准化，标本用量少，敏感性高，特异性强，在许多医院和血站被应用。新生儿的红细胞抗原未完全形成、抗体较弱未完全产生，易受母体抗体的影响等原因，血型鉴定一般正反定型不一致，但随着微柱凝胶技术的应用，正定型的抗原检出率达到100%，反定型的灵敏度得到了很大的提高，因而正反定型一致的比例有所提高，如范丽霞等[2]报道达到了48.7%，周金安等[3]报道的57.9%。马曙轩等[4]研究的用试管法进行反定型检测时，可以根据ABO血型抗体的特性，将试管置于4 ℃冰箱孵育（4 ℃时抗原抗体反应最强），加大血清用量来提高检出率，而微柱凝胶法则受反应孔体积等限制无法做到。因此，试管法检测同样月龄婴幼儿ABO血型抗体时，检出率可提高至94.18%。李萌等[5]所做的实验表明，正定型时微柱凝胶法能检测较弱抗原，而反定型时采用微柱凝胶法结合盐水试管法离心3次能更好地检出较弱抗体。对新生儿反定型而言只有两者结合起来才能做出正确的结果。

2.2 母亲血清IgG抗A（B）效价检测 母亲是O型，新生儿是A型或B型，分别检测IgG抗A 或IgG抗B效价。临床上通常以1：64作为临界值，如果母亲血清中IgG抗A（B）效价>64，提示有引起新生儿溶血病的可能，需密切观察；在妊娠初期每月做一次检查，妊娠后期每周做一次检查，前、后效价相比较升高超过4倍胎儿可能受害。母亲血清中抗A（B）效价>512，近100% 发病。用微柱凝胶法检测孕妇血清IgG抗A（B）抗体效价，可以预测胎儿在妊娠期间的危险性，有研究表明其灵敏度高于传统的试管法[6]，随着孕妇血清IgG抗A（B）抗体效价增高，新生儿溶血病发病率增加，孕期中测定孕妇血清IgG抗体效价，可为产前诊断和预防ABO血型不合引起的HDN提供诊断依据。微柱凝胶的敏感性太强，检出抗体效价强于试管法，林燕等[7]建议微柱凝胶法检测IgG抗A（B）效价时应以

2.3 ABO 以外抗体检测 如果在新生儿血清中或细胞上发现ABO以外抗体，在母亲血清中也应检出相同特异性的抗体，且母亲红细胞上应不含相应的血型抗原。产前检测不规则抗体对预防新生儿溶血具有重要意义[10]。微柱凝胶技术用于检测新生儿溶血病，与传统的抗人球蛋白试验检测孕妇异性抗体及效价相比，微柱凝胶技术更敏感，快速，特异性更好，结果更易于观察[11]。

2.4 HDN检测的三项试验 新生儿红细胞直接抗人球蛋白试验、血清抗体游离试验及红细胞抗体放散试验称为HDN检测的“三项试验”。仅直抗阳性、游离试验不能证实为HDN，两者均阳性可以证实HDN，释放试验阳性即可确证为HDN[12-13]。

2.4.1 直接抗人球蛋白试验 用以检测新生儿红细胞是否被IgG 抗体致敏，ABO 新生儿溶血病直接抗人球蛋白试验常为弱阳性或阴性[14]，是因为新生儿的A（B）抗原密度比成人低，所以被结合的抗体亦很少。与标本送检的时间也有关系，有研究认为ABO、Rh及其他血型不合HDN 患儿出生后24h内阳性检出率为91.5%，1～3 d阳性检出率为81.6%，4～7 d阳性检出率为38.4%，8～14 d阳性检出率为16.8%，15 d以后阳性检出率为0%。提示HDN 患儿出生后24 h以内阳性检出率最高，随着时间的延长阳性检出率也逐渐下降。这是因为游离抗体只在出生后几天内存在，之后会逐渐消失，致敏的红细胞也会在出生后逐渐破坏[15]。Rh新生儿溶血病的直抗相当强，一般大于或等于2+，新生儿直抗强弱是区分ABO和Rh溶血病的主要标志。钟水权[16]、代方等[17]研究证实微柱凝胶卡式法检出直接抗人球蛋白试验阳性率、抗体游离试验阳性及抗体放散试验阳性率明显高于试管法。

2.4.2 血清抗体游离试验 用间接抗人球蛋白试验检测新生儿血清中是否有游离的IgG抗体。Rh溶血病要求最好用母亲的血清代替婴儿血清做一组谱细胞。由于婴儿体内的所有血型抗体都来自母亲，母亲血清中的抗体效价高，血清量多，结果更可靠。使用母亲血清时只有当检出IgG不规则抗体，而且该抗体能够与婴儿红细胞反应，才可判定为阳性。同时，用婴儿自身血清加相应的A、B细胞可以排除合并ABO溶血病。抗人球蛋白法对操作人员的技术要求较高，易受人为因素的影响，需要洗涤细胞，操作时间长，标本用量多，有研究证实微柱凝胶技术用于检测新生儿溶血病，方法简便、快速、判断结果标准[18-19]。

2.4.3 红细胞抗体放散试验 ABO新生儿致敏红细胞通过加热使抗体释放，Rh溶血病用乙醚放散，在放散液中加入酶处理的含有相对应抗原的红细胞使其致敏，洗涤3 次后作间接抗人球蛋白试验。Rh溶血病用放散液与一组谱细胞反应，确定放散液中不规则抗体的特异性。必要时另加相应的A、B细胞排除ABO溶血病。使用酶处理的红细胞能提高抗体的检出率，但操作复杂，对技术人员操作要求高，难度大，时间长，且在操作过程中易出现假阴性结果。近几年微柱凝胶技术对临床标本检测的敏感性大大提高。符宝铭等[20]在临床观察中，微柱凝胶法检测溶血三项试验结果与临床符合率达95%，高于抗人球蛋白法（符合率仅有87%），可见微柱凝胶法比传统试管法更具优势。

3 小结

微柱凝胶法具有操作简便，易于标准化，方法学敏感，特异性强，结果能较长时间保存，能检出较弱的抗体。正确运用微柱凝胶免疫检测技术能够为临床提供快速准确的实验报告，有利于临床医生对新生儿进行早期诊断、早期治疗，为新生儿溶血病提供可靠诊断依据，适用于临床常规检测，值得推广应用，对预防和降低新生儿溶血病具有重要的意义。

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（收稿日期：2014-05-13） （本文编辑：石亚飞）